王明森，張菊紅，孫慧娟，李大偉，劉 杰*

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

吉非替尼片由英國(guó)阿斯利康公司研制，商品名為IRESSA，于2007年在中國(guó)上市，治療既往接受過(guò)化療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因敏感突變患者可用于一線治療。它能與EGFR的三磷酸腺苷（ATP）激酶結(jié)合位點(diǎn)上的ATP 競(jìng)爭(zhēng)，阻斷其酪氨酸激酶活性，進(jìn)而阻斷 EGFR 的信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻礙腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1]。

吉非替尼易溶于冰醋酸、二甲基亞砜；溶于吡啶；難溶于四氫呋喃；微溶于甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、異丙醇和乙腈。按生物藥劑分類(lèi)系統(tǒng)（BCS），吉非替尼屬于BCS 2類(lèi)，即：低溶解性、高滲透性藥物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)吉非替尼片制備工藝關(guān)鍵點(diǎn)的研究，制備出合格的樣品。依據(jù)仿制藥一致性的評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則，以體外溶出曲線擬合度為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)吉非替尼自制片和參比制劑進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)[2]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SF-130B型萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海天和制藥機(jī)械公司）；HLSG-10型濕法制粒機(jī)（北京國(guó)藥龍立機(jī)械公司）；ZPW-21B型旋轉(zhuǎn)壓片機(jī)（上海天和制藥機(jī)械公司）；LDCS型實(shí)驗(yàn)室高效包衣系統(tǒng)（USA Vector Corporation）；Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫科技公司）；RCZ-8M溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)）；電子分析天平XS-205（美國(guó)梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

參比制劑（英國(guó)阿斯利康公司，批號(hào)MC978）；吉非替尼原料藥（自制，批號(hào)170506）；一水乳糖（Foremost）；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（美國(guó)FMC）；聚維酮K30（PVP K30，ISP）；十二烷基硫酸鈉（SDS，山河輔料）；微晶纖維素（山河輔料）；硬脂酸鎂（山河輔料）；胃溶型薄膜包衣粉（卡樂(lè)康）；結(jié)晶乙酸鈉（科密歐）；磷酸二氫鉀（國(guó)藥集團(tuán)）；鹽酸（科密歐）；氫氧化鈉（科密歐）；冰醋酸（科密歐）；純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 吉非替尼單位制劑的處方組成[3]

吉非替尼250 mg，一水乳糖130 mg，微晶纖維素70 mg，羧甲基淀粉鈉17 mg，聚維酮K30 20 mg，SDS 2.2 mg，硬脂酸鎂4.5 mg，包衣增重2 %。

2.2 吉非替尼片的制備

（1）原料過(guò)200目，輔料過(guò)80目備用；（2）將原輔料混合均勻；（3）配制合適的PVP K30和SDS溶液，溶解完全，然后加入（2）中混合好的原輔料中制備軟材，再用20目篩網(wǎng)制粒，60 ℃烘干，20目篩網(wǎng)整粒；（4）加入處方量的硬脂酸鎂總混；（5）包衣。采用此工藝，制備3個(gè)批次（每批次2000片），批號(hào)為170201，170202，170203。

2.3 溶出曲線測(cè)定方法的建立

2.3.1 溶出介質(zhì)選擇和配制[4]吉非替尼溶解度與pH值相關(guān)，pKa值分別為5.42和7.24。pH≤3.4時(shí)微溶，pH＞3.4時(shí)，吉非替尼溶解度迅速下降，pH＞6時(shí)，幾乎不溶。因而選擇在介質(zhì)pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、2 %吐溫80水溶液和含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中評(píng)價(jià)自制片和對(duì)照片的溶出相似性。

根據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]配制介質(zhì)pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、2 %吐溫80水溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液的配制 稱(chēng)取吉非替尼對(duì)照品約25 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇10 ml溶解，再加溶出介質(zhì)稀釋并定容成每1 ml含10 μg左右的溶液，備用。

2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇，取2.3.2項(xiàng)下溶液，配制一定濃度的吉非替尼溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，吉非替尼的最大吸收波長(zhǎng)分別為340 nm（pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液）、334 nm（含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、335 nm（2 %吐溫80水溶液）

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)定吉非替尼對(duì)照品25 mg，置入100 ml量瓶，用甲醇10 ml溶解，再用溶出介質(zhì)分別稀釋到刻度，得到濃度為250μg/ml的貯備液。分別用介質(zhì)pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、2 %吐溫80水溶液稀釋成濃度為3，5，10，15，20，25 μg/ml的溶液，分別在340，340，334，335 nm處測(cè)定吸光度，以濃度C對(duì)相應(yīng)的吸光度A進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，4種介質(zhì)的回歸方程分別為A=0.035C-0.0056（r=0.9998），A=0.045C-0.0056（r=0.9997），A=0.041C-0.0078（r=0.9998），A=0.044C-0.0081（r=0.9999），表明在濃度3～25 μg/ml之間線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取上述2.3.4項(xiàng)下濃度 10 μg/ml的對(duì)照品溶液，在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，在4種介質(zhì)中測(cè)定的RSD值分別為0.51 %，0.63 %，0.71 %，0.65 %，均≤2 %，說(shuō)明該測(cè)定方法的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下濃度為 10 μg/ml的對(duì)照品溶液，分別于0，1，2，3，5，7，10 h在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示吉非替尼在4種介質(zhì)中吸光度的RSD值分別為0.35 %，0.43 %，0.51 %，0.47 %，表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取處方量的輔料，加入一定量的吉非替尼對(duì)照藥，配置成含藥量高、中、低3個(gè)濃度的處方。分別采用4種介質(zhì)配制成相應(yīng)濃度的樣品溶液，在4種介質(zhì)中的回收率分別為99.45 %（RSD=0.51 %），99.12 %（RSD=0.55 %），98.45 %（RSD=0.67 %），99.34 %（RSD=0.78 %），表明藥物在4種介質(zhì)中回收率良好。

2.4 關(guān)鍵工藝的研究

2.4.1 粉碎 吉非替尼原料藥是BCS 2類(lèi)，溶解度低，在水中幾乎不溶，粒度大小會(huì)對(duì)溶出度有影響，根據(jù)Ostwald-Freundli-ch方程，減少粒徑能增加溶解度，加快溶出速率。主要采用分樣篩篩分、萬(wàn)能粉碎（100目篩）、氣流粉碎3種方式來(lái)處理原料藥，不同粉碎分式得到的粒度結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 原料藥粒度分布

對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩分得到的粒徑明顯太粗，不適合后續(xù)研究。粒徑越小越能促進(jìn)溶出，氣流粉碎得到的粒徑最小，但氣流粉碎過(guò)程耗時(shí)，損失原料多。雖然萬(wàn)能粉碎得到的粒徑稍大于氣流粉碎，但考慮到萬(wàn)能粉碎工藝簡(jiǎn)單，損失少，綜合考慮最終選擇萬(wàn)能粉碎。

2.4.2 混合 原輔料的混合對(duì)于含量的均勻度非常重要，為了保證混合工序中原輔料混合均勻，固定設(shè)備攪拌速度，測(cè)定不同混合時(shí)間下的混合均勻度（RSD值）。稱(chēng)取處方量的吉非替尼、一水乳糖、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等加入高效濕法混合制粒機(jī)中，混合，在6個(gè)不同位置（上、中、下）取樣，紫外分光光度法測(cè)原料藥含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 混合時(shí)間及均勻度

由表2可見(jiàn)，在設(shè)定的轉(zhuǎn)速下，原、輔料在濕法混合制粒機(jī)中混合 5 min，即可實(shí)現(xiàn)混合均勻（RSD＜2 %）。為了確保物料能充分混合均勻，將該混合工藝的混合時(shí)間定為10 min。

2.4.3 干燥時(shí)間 濕顆粒在60 ℃下鼓風(fēng)干燥，每30 min翻盤(pán)一次，分別烘干30，60，90，120 min，采用水分測(cè)定儀，溫度105 ℃，時(shí)間10 min，分別測(cè)定水分，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小試3批顆粒水分測(cè)定結(jié)果

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，干燥溫度55～65 ℃，干燥90 min后顆粒水分可以滿足壓片的需要，干燥60 min水分偏大，干燥2 h水分太少，也不利于壓片。所以最終選擇的干燥時(shí)間為90 min。

2.5 溶出曲線評(píng)價(jià)[6]

參照中國(guó)藥典2015版0931第二法制訂了溶出度測(cè)定方法。分別采用介質(zhì)pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、2 %吐溫80水溶液各900 ml為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)經(jīng)脫氣處理，轉(zhuǎn)速為50 r/min，溫度37 ℃，依法操作，分別于5，10，15，30，45，60 min取樣10 ml，并及時(shí)補(bǔ)液，濾過(guò)后，取續(xù)濾液分別用4種介質(zhì)稀釋成每1 ml中含吉非替尼10 μg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；另取吉非替尼對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，置入50 ml量瓶，加甲醇10 ml溶解，加4種介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，分別加4種介質(zhì)并稀釋成每1 ml中約含吉非替尼10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液和對(duì)照品溶液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法[7]，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算每個(gè)點(diǎn)的溶出量。

式中，As為對(duì)照品溶液的吸光度值，Ai為供試品溶液的吸光度值，Cs為對(duì)照品溶液濃度（μg/ml）。

按上述擬定的溶出度測(cè)定條件，分別測(cè)定自制制劑（批次為170201，170202，170203）與參比制劑在4種介質(zhì)中的溶出度。見(jiàn)圖1～4。

圖1 吉非替尼片在pH 1.0鹽酸溶液中的溶出曲線

圖2 吉非替尼片在pH 4.5醋酸鹽緩沖液中的溶出曲線

圖3 吉非替尼片在2%吐溫80水中的溶出曲線

圖4 吉非替尼片在含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出曲線

從圖1～4可見(jiàn)，自制制劑和參比制劑在pH 1.0和pH 4.5介質(zhì)中15 min的溶出度達(dá)85 %以上，可認(rèn)為兩者在此溶出條件下溶出曲線相似。吉非替尼在水溶液中的溶解度具有pH依賴(lài)性，在pH 4～6之間，溶解度急劇下降，隨pH值升高，溶解度降低，體外溶出減緩，參比片在水中和pH 6.8磷酸緩沖鹽溶液中的溶出度很低，不足5 %，加入2 %吐溫80后，溶出度明顯升高。分別測(cè)定自制片和參比片在pH 6.8磷酸鹽緩沖液（含2 %吐溫80）和水溶液（含2 %吐溫80）2種介質(zhì)中的溶出曲線，按《仿制藥生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[8]，計(jì)算相似因子f2，其f2值分別為65.45，70.2，均大于50，可認(rèn)為自制制劑和參比制劑在這2種介質(zhì)中具有相似性。

2.6 樣品加速考察后的溶出曲線研究

將制備的3批次樣品（批號(hào)170201，170202，170203）和參比制劑置于40 ±2 ℃，相對(duì)濕度（RH）75%±5 %條件下加速考察6個(gè)月。分別在pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、2 %吐溫80水溶液介質(zhì)中測(cè)定溶出度，并計(jì)算f2值。結(jié)果見(jiàn)表4，表明制備的樣品在加速考察后溶出曲線依然具有相似性。

表4 吉非替尼片的溶出度結(jié)果

3 討論

吉非替尼為難溶性藥物，其粒度大小會(huì)對(duì)溶出度有影響，故對(duì)原料的粒度和粉碎方式進(jìn)行了研究，最終確定采用萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)原料藥進(jìn)行粉碎。吉非替尼原料含其無(wú)水物和三水合物兩種晶型，制備過(guò)程中有可能轉(zhuǎn)晶[9]。故制劑制備工藝應(yīng)注意控制環(huán)境濕度和物料水分，所以對(duì)物料干燥時(shí)間進(jìn)行了研究，最終選擇的干燥時(shí)間為90 min。本研究采用常規(guī)濕法制粒壓片方法制備吉非替尼片，通過(guò)對(duì)粒度、混合均勻度及干燥時(shí)間的研究，確定了關(guān)鍵工藝參數(shù)。由此工藝制備3個(gè)批次（每批次2000片），進(jìn)行溶出曲線評(píng)價(jià)。

根據(jù)吉非替尼溶解度pH依賴(lài)性，且在pH 4～6之間溶解度急劇下降的特點(diǎn)，重點(diǎn)比較了pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸緩沖液、含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、2 %吐溫80水溶液4種介質(zhì)中的溶出行為，4種介質(zhì)中吉非替尼片溶出行為有明顯差異，且具有一定代表性。數(shù)據(jù)顯示，自制3批制劑與參比制劑在該4種介質(zhì)中擬合度均高于50，說(shuō)明二者溶出曲線具有相似性。其中吉非替尼在水中和磷酸6.8緩沖液中不溶，進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)采用5 %吐溫水溶液作為溶出介質(zhì)，但45 min溶出即高于85 %，溶出略快。通過(guò)降低吐溫用量至2 %，60～90 min間溶出達(dá)85 %以上，曲線平緩且溶出完全，具有一定區(qū)分度，所以采用了含2 %吐溫80的pH 6.8磷酸鹽緩沖液和2 %吐溫80水溶液兩種介質(zhì)，結(jié)果表明自制3批制劑與參比制劑在該2種介質(zhì)中溶出曲線具有相似性。