何 偲，黃元霞，邱忠平，李 萍，徐 柳

（西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都 610031）

關(guān)鍵字：桑葚；酵素；紅糖；抗氧化物質(zhì)；抗氧化活性

人體因新陳代謝和外界因素的影響會不斷產(chǎn)生自由基，自由基的過量產(chǎn)生會打破人體正常平衡而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致細胞損傷和變異，從而加速衰老，并引發(fā)各種炎癥性疾病、糖尿病、甚至誘發(fā)癌癥[1-3]。酵素是以水果或蔬菜為原料，添加一定比例的糖發(fā)酵而成，其中富含維生素C、總酚、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等具有抗氧化活性的物質(zhì)，能抑制或消除自由基，阻止機體細胞受到自由基的損害，減少機體的損傷和疾病的發(fā)生[4-5]。但這些抗氧化物質(zhì)穩(wěn)定性較差，容易受到pH值、溫度、有機酸、光照、氧、糖含量等影響而發(fā)生變化[6]。因此，減少抗氧化物質(zhì)的流失是未來保健食品的研究重點。紅糖富含蔗糖、氨基酸、微量元素、抗氧化性物質(zhì)等成分，具有極高的營養(yǎng)價值。適量的紅糖對保持酵素營養(yǎng)成分含量和提升抗氧化活性具有重要意義。

目前，我國對酵素的抗氧化性研究大多集中在其發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化規(guī)律[7-8]，關(guān)于紅糖比例對酵素抗氧化性能的影響研究未見報道。本文以不同比例的桑葚與紅糖制作的酵素為研究對象，比較其中的維生素C、總酚、花色苷等抗氧化活性物質(zhì)含量及其抗氧化活性。并應(yīng)用模糊數(shù)學綜合分析法得出最優(yōu)的桑葚與紅糖初始質(zhì)量比例，為開發(fā)具有高抗氧化性的酵素產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eppendorf 5427R臺式高速離心機（Eppendorf）；V-1100D型可見分光光度計（上海美譜達）；JY5002電子天平（上海舜宇恒平）；UV-2450紫外分光光度計（日本島津公司）；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（上海躍進）；pHS-3C+總酸計（成都世紀方舟）；發(fā)酵罐（10 L，上海安買）。

1.2 材料

桑葚，紅糖（桂林百壽元食品公司），均為市售。

2 方法

2.1 桑葚酵素的制備

用無菌水輕輕沖洗桑葚表面除去塵土，在無菌環(huán)境下自然晾干；將紅糖在紫外燈下照射殺菌1 h。將桑葚與紅糖（總質(zhì)量為12 kg）分別按質(zhì)量比1:1，3:1，5:1，7:1，9:1加入已滅菌的發(fā)酵罐中混勻，分別編號為Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#，密封后置暗處常溫發(fā)酵360 d。為防止外源微生物的污染，所有操作均在無菌環(huán)境下進行。

2.2 測定方法

采用pH計測定pH值；NaOH滴定法測定總酸[8]；3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量[9]；重鉻酸鉀氧化法測定酒精度[10]；紫外分光光度法測定維生素C含量[11]，F(xiàn)oli-Ciocalteu’s法測定總酚含量[12]，pH試差法測定花色苷含量[13]，結(jié)果分別以等價沒食子酸、抗壞血酸、矢車菊素-3-葡糖苷表示；取酵素的10倍稀釋液1 ml測定還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率進行，方法參照文獻[14]。

2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗結(jié)果均為5個平行樣的平均值，采用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行基本處理，SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行顯著性及相關(guān)性分析，模糊數(shù)學分析法綜合評判出最優(yōu)桑葚與紅糖比例。

3 結(jié)果

3.1 5組桑葚酵素理化指標的比較

采用pH值、總酸、還原糖含量、酒精度作為桑葚酵素理化指標，5組桑葚酵素的理化指標檢測結(jié)果見表1。

表1 5組桑葚酵素的理化指標比較（±s）

表1 5組桑葚酵素的理化指標比較（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

組別 pH 蔗糖含量/mg·ml-1 還原糖含量/mg·ml-1 總酸/g·L-1 酒精度/%Ⅰ# 4.16 347.016±0.223 491.729±3.337 4.719±0.001 4.615±0.003Ⅱ# 3.63** 119.915±0.111** 186.453±1.539** 9.976±0.004** 5.849±0.003**Ⅲ# 3.91** 134.805±0.077** 89.060±0.214** 15.109±0.06** 8.342±0.006**Ⅳ# 3.77** 41.979±0.077** 33.469±0.233** 15.440±0.06** 6.858±0.005**Ⅴ# 3.78** 33.945±0.309** 3.680±0.203** 16.350±0.06** 4.833±0.003**

由表1可見，Ⅰ#的pH、蔗糖、還原糖含量最高（P＜0.01），總酸、酒精度最低（P＜0.01）。

表2 5組桑葚酵素的抗氧化活性比較（±s）

表2 5組桑葚酵素的抗氧化活性比較（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

組別 維生素/mg·ml-1 總酚/mg·ml-1 花色苷/mg·L-1 還原力 對羥自由基清除率/%對超氧自由基清除率/%Ⅰ# 90.348±0.879 14.935±0.606 101.553±3.654 0.283±0.003 36.142±0.115 12.171±0.061Ⅱ# 82.026±0.937** 16.244±0.610** 52.730±3.654** 0.072±0.003** 13.301±0.130** 13.675±0.558**Ⅲ# 94.727±1.573** 12.592±0.398** 46.871±3.904** 0.176±0.002** 14.338±0.167** 13.081±0.324**Ⅳ# 83.759±1.350** 12.394±0.484** 27.341±2.392** 0.157±0.003** 14.453±0.130** 16.855±0.314**Ⅴ# 82.708±0.764** 11.545±0.651** 21.482±2.392** 0.162±0.003** 16.833±0.410** 13.442±0.732**

3.2 5組桑葚酵素抗氧化活性比較

以桑葚酵素的維生素C、總酚、花色苷含量、還原力、對羥自由基清除能力和對超氧自由基的清除能力作為桑葚酵素抗氧化活性的指標，結(jié)果見表2。

由表2可見，5組桑葚酵素的維生素C含量均高于80 mg/ml，Ⅰ#的維生素C含量略低于Ⅲ#，高于Ⅱ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）。Ⅰ#的總酚含量為14.935 mg/ml，略低于Ⅱ#，高于Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）?；ㄉ蘸侩S著紅糖比例的降低逐漸降低，Ⅰ#的花色苷含量高于其余4組（P＜0.01）。由此可見，Ⅰ#即桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時所得桑葚酵素的抗氧化物質(zhì)含量相對較高。

5組桑葚酵素中Ⅰ#的還原力、對羥自由基清除率最高，對超氧自由基清除率5組差別不大。由此可見，Ⅰ#即桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時所得桑葚酵素的體外抗氧化活性相對較高。

3.3 模糊數(shù)學分析法評判結(jié)果

模糊數(shù)學分析法是模糊數(shù)學提供的一種解決多因素、多指標評估問題的數(shù)學模型[15]。由于維生素C含量、總酚含量、花色苷含量等各抗氧化物質(zhì)含量和還原力、對羥自由基清除率、對超氧自由基清除率等抗氧化活性指標在數(shù)據(jù)和單位上都有很大的差別，因此要對5組桑葚酵素的抗氧化活性進行比較，不能單單通過比較某一個抗氧化性指標的檢測數(shù)據(jù)，可以通過模糊數(shù)學分析法對各抗氧性指標的檢測數(shù)據(jù)進行無因次化處理而進行綜合分析。

首先選取五組桑葚酵素抗氧化性能評價的指標體系U，U={uij}，其中i表示5組酵素的維生素C、總酚、花色苷、還原力、對羥自由基清除率、對超氧自由基清除率6項指標，j表示組別數(shù)。uij表示i項指標的第j組數(shù)值。再將表3中各抗氧化性指標原始數(shù)據(jù)的平均值進行極值標準化處理，構(gòu)成模糊轉(zhuǎn)化矩陣R，最大值記為1（maxij=1），最小值記為0（minij=0）。中間值（rij）根據(jù)模糊數(shù)學分析法所屬函數(shù)的定義進行計算，即R=（rij），rij=（uij-minij）/（maxij-minij）。采用標準離差法計算權(quán)重。所得模糊轉(zhuǎn)化矩陣R結(jié)果見表3。

表3 模糊轉(zhuǎn)化矩陣R

通過等權(quán)和加權(quán)法分別對5組桑葚酵素的抗氧化活性進行比較，數(shù)值越大表明其抗氧化性能越優(yōu)，所得結(jié)果見表4。

表4 模糊數(shù)學分析法結(jié)果及排序

綜合分析結(jié)果取等權(quán)和加權(quán)的和值，數(shù)值越大表明抗氧化活性越高。從表4可見，抗氧化活性排序依次為Ⅰ#＞Ⅲ#＞Ⅱ#＞Ⅳ#＞Ⅴ#。即桑葚與紅糖的初始質(zhì)量比為1:1時所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。

3.4 抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系之間的相關(guān)性分析

采用SPSS 20.0 對維生素C、總酚、花色苷3種抗氧化物質(zhì)和還原力、對羥自由基清除率和超氧自由基清除率3種抗氧化體系進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

表5 抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系之間的相關(guān)性分析

由表5可見，抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系間呈不同相關(guān)性。其中，花色苷與還原力、對羥自由基清除率和超氧自由基清除率呈顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.631，0.853，0.589（P＜0.01）。

4 討論

4.1 初始糖含量與酵母菌對糖的轉(zhuǎn)化有直接聯(lián)系。酵素發(fā)酵過程中酵母菌利用桑葚和紅糖完成自身繁殖并將糖轉(zhuǎn)化為酒精等代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，5組桑葚酵素的酒精含量大小順序為：5:1＞7:1＞3:1＞9:1＞1:1。這與馬兆瑞等[16]的研究結(jié)果一致，發(fā)酵產(chǎn)物的酒精含量隨著糖含量的增加而增加，但糖含量過高會抑制酵母菌的發(fā)酵，導致殘余蔗糖含量增加。因此，5組桑葚酵素的殘余蔗糖、還原糖含量隨著桑葚與紅糖比例的增加而逐漸減少。

4.2 酵素中高濃度的糖能阻止抗氧化物質(zhì)的氧化，有利于維生素C、總酚和花色苷的保存。維生素C、總酚、花色苷等抗氧化物質(zhì)隨著存放時間的延長極易氧化損失。王亞楠等[17]發(fā)現(xiàn)，添加蔗糖能降低溶液中的含氧量，從而提高維生素C的保存率；樊金玲等[18]發(fā)現(xiàn)，蔗糖抑制花色苷的降解，從而提高了花色苷的貯藏穩(wěn)定性，且抑制程度與蔗糖濃度呈正相關(guān)。因此，雖然桑葚與紅糖初始比例為1:1時的桑葚質(zhì)量最少，但殘余蔗糖含量最高，所得酵素的維生素C、總酚、花色苷含量高。

4.3 還原力、對羥自由基清除率、對超氧自由基清除率通常是體外抗氧化活性的常用體系。維生素C、總酚、花色苷等抗氧化物質(zhì)具有抑制自由基產(chǎn)生或直接清除自由基、激活抗氧化酶體系等作用[19]。但各種抗氧化物質(zhì)在抗氧化活性體系中呈現(xiàn)不同的相關(guān)性[20-21]。本文通過SPSS 22.0對抗氧化物質(zhì)與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，花色苷與還原力、對羥自由基清除率和超氧自由基清除率呈顯著正相關(guān)，而維生素C、總酚與其無明顯相關(guān)性，表明花色苷含量對體外抗氧化活性影響最大。因此，初始質(zhì)量比為1:1時所得桑葚酵素的花色苷含量最高，其還原力、對羥自由基清除率也最強。

5 結(jié)論

應(yīng)用模糊數(shù)學分析法對桑葚酵素抗氧化活性進行綜合評判，排序依次為：1:1＞5:1＞3:1＞7:1＞9:1。表明桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時，所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。