張哲瑋，邢國(guó)明

（1.晉中市林業(yè)局，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030801）

杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（RhododendronL.）植物在全球約有960種[1]，許多種類色彩鮮艷，是園藝觀賞的重要品種，部分種類的花、葉、根具有藥用和工業(yè)價(jià)值[2]。山西省野生杜鵑花屬植物僅有照山白（Rhododendron micranthum）和迎紅杜鵑（Rhododendron mucronulatum）[3]，對(duì)野生杜鵑的引種選育既可豐富山西省杜鵑花的多樣性，還可綜合開(kāi)發(fā)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益。

RAPD（Random amplified polymophic DNA）是由WILLAMS等提出的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)[4]，其特點(diǎn)是所需DNA用量少、對(duì)DNA的純度要求不高、不涉及放射性同位素、程序簡(jiǎn)單、靈敏度高、多態(tài)性豐富[5-7]，在植物種質(zhì)資源品種鑒別、親緣關(guān)系分析方面應(yīng)用廣泛。

植物育種的關(guān)鍵是正確選擇親本材料，如果親本的遺傳基礎(chǔ)狹窄，將難以培育出優(yōu)良的新品種。杜鵑花屬植物種類繁多，相似品種用傳統(tǒng)分類學(xué)區(qū)分困難。因此，分析杜鵑花屬植物的親緣關(guān)系，對(duì)于杜鵑花的選育具有重要的指導(dǎo)意義。目前，已有學(xué)者陸續(xù)采用分子標(biāo)記技術(shù)研究杜鵑花的親緣關(guān)系，但大多集中在杜鵑花分布廣泛的地區(qū)[8-10]，山西省有關(guān)杜鵑花的分子標(biāo)記尚未開(kāi)展。

本研究運(yùn)用RAPD技術(shù)，分析山西省2種野生杜鵑和6個(gè)常見(jiàn)的引進(jìn)品種的親緣關(guān)系，旨在為山西省杜鵑花的分類鑒定和遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試11份樣品采集自山西省不同區(qū)域，照山白和迎紅杜鵑從野外采集，6個(gè)園藝品種分別由晉中市和太原市苗圃提供（表1）。選取植株嫩葉放入硅膠密封干燥，-20℃保存[11-12]。

表1 供試材料及其地理信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取及檢測(cè) 選取一個(gè)樣品分別采用CTAB法[13]與核沉淀法[14]提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量（圖1），比較之后確定使用核沉淀法。用微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（Nanodrop ND-1000）檢測(cè)所提DNA的濃度及純度，并最終稀釋成20 ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 隨機(jī)抽取3個(gè)樣品的DNA，對(duì)50條引物進(jìn)行篩選，將能擴(kuò)增出條帶的引物進(jìn)行二次篩選，依據(jù)電泳結(jié)果，挑選擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物用于杜鵑花的親緣關(guān)系研究。

1.2.3 建立RAPD-PCR體系 PCR擴(kuò)增程序參照周蘭英等[15]的方法，即94℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，36℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，共 45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物于4℃保存。

RAPD-PCR反應(yīng)體系[16]經(jīng)優(yōu)化確定為：20μL反應(yīng)液中包括 2 μL 模版 DNA，0.3 μL Taq DNA 聚合酶（5 U），2 μL 10×buffer（2 mmol/L含Mg2+），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.2 μL 引物 （20 U），13.3 μL ddH2O。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，使用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)電泳圖上擴(kuò)增譜帶的有無(wú)分別賦值，有帶記為1，無(wú)帶記為0，將得到的1-0矩陣用NTSYS軟件處理，以Nei-Li公式計(jì)算遺傳相似系數(shù)。

其中，GS為遺傳相似系數(shù)，Nij為樣品i和j共有的擴(kuò)增片段數(shù)，Ni和Nj分別代表樣品i，j的擴(kuò)增片段數(shù)目。

按照非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析[17-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

從50條引物中選出4條引物（表2），擴(kuò)增出的條帶清晰，重復(fù)性和多態(tài)性均較好（圖2），符合分子標(biāo)記對(duì)擴(kuò)增條帶的要求。

表2 試驗(yàn)篩選出的引物

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

用篩選出的4條引物對(duì)11個(gè)供試樣品進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，由圖3，4可知，共擴(kuò)增出44條DNA條帶，其中，多態(tài)性條帶數(shù)28條，多態(tài)位點(diǎn)率63.64%，平均每個(gè)引物擴(kuò)增譜帶11條，說(shuō)明杜鵑花屬植物在分子水平上多態(tài)性是比較豐富的。通過(guò)分析，5個(gè)亞屬中都存在本亞屬特有的共有譜帶，分別為杜鵑亞屬3條、迎紅杜鵑亞屬2條、馬銀花亞屬2條、羊躑躅亞屬1條、映山紅亞屬3條，擴(kuò)增結(jié)果在一定程度上體現(xiàn)了各亞屬的特性。

2.3 親緣關(guān)系分析

表3 8種杜鵑（11個(gè)樣品）的相似系數(shù)

將統(tǒng)計(jì)的1-0數(shù)據(jù)用NTSYS軟件處理，計(jì)算得出各樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS）。由表3可知，11個(gè)樣本間的GS在0.238 8～0.970 2，平均值為0.540 6，說(shuō)明各樣本間遺傳基礎(chǔ)差異較大。照山白與迎紅杜鵑的GS最小，為0.238 8，說(shuō)明親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；最大GS為0.970 2，在照山白樣本間產(chǎn)生，表明同種杜鵑在不同地域上仍有很高的同源性；刺毛杜鵑與馬銀花之間的GS為0.850 8，錦繡杜鵑與皋月杜鵑之間的GS為0.880 6，表明同一亞屬間的品種親緣關(guān)系較近；迎紅杜鵑與羊躑躅為不同亞屬，GS卻高達(dá)0.850 8，表明二者在形態(tài)學(xué)上雖有一定差異，但遺傳背景卻有很高的同源性。

2.4 聚類結(jié)果分析

用UPGMA方法對(duì)8種杜鵑花（11個(gè)樣品）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5所示，11個(gè)樣品在遺傳相似系數(shù)（GS）為0.78附近被劃分成3大類群，第1類群為3個(gè)照山白樣品，屬杜鵑亞屬；第2類群中，迎紅杜鵑與羊躑躅、刺毛杜鵑與馬銀花在GS為0.85處先聚為2組，隨后聚為一類；第3類群為滿山紅、錦繡杜鵑和皋月杜鵑，同屬映山紅亞屬。第2，3類群在GS為0.64處聚類后，在GS為0.33處與第1類群最終聚為一類，聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類相吻合。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)能快速準(zhǔn)確地對(duì)植物材料進(jìn)行鑒別，其中，RAPD，AFLP[20]等技術(shù)更便于進(jìn)行植物的遺傳多樣性分析。RAPD標(biāo)記作為以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，具有所需DNA用量少、對(duì)模板DNA的純度要求不高、不涉及放射性同位素、程序簡(jiǎn)單、靈敏度高、多態(tài)性豐富的優(yōu)點(diǎn)。本研究應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)試驗(yàn)材料間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，提高了試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

本試驗(yàn)使用從50條引物中選出的4條引物，對(duì)8種杜鵑花進(jìn)行擴(kuò)增，共得到44條清晰條帶，其中，多態(tài)性條帶28條，多態(tài)位點(diǎn)率63.64%，4條引物能夠較好地將供試材料區(qū)分開(kāi)，表明RAPD標(biāo)記對(duì)杜鵑花的遺傳多樣性分析是可行的。

用Nei-Li公式計(jì)算經(jīng)NTSYS軟件處理的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，得出遺傳相似系數(shù)（GS）在0.238 8～0.970 2，平均值為0.540 6，表明這8個(gè)品種具有較豐富的遺傳多樣性。UPGMA聚類結(jié)果顯示，在不同遺傳相似系數(shù)上，8個(gè)品種可分為多個(gè)亞屬，在GS為0.78附近，11份供試材料劃分成3大類群，第1類群的照山白屬于杜鵑亞屬照山白亞組，與其他樣品的GS均在0.42以下，說(shuō)明與其他品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，原因可能是照山白的形態(tài)和習(xí)性與其余供試品種有較大差異；第2類群為迎紅杜鵑、羊躑躅、刺毛杜鵑和馬銀花，分別屬于迎紅杜鵑亞屬、羊躑躅亞屬和馬銀花亞屬（刺毛杜鵑、馬銀花），4個(gè)品種在形態(tài)學(xué)上差異明顯，但在基因水平上具有很高的同源性，特別是迎紅杜鵑和羊躑躅，不同亞屬的GS達(dá)到了0.850 8，這與杜鵑花在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中基因交流頻繁，且屬異花授粉植物有關(guān)[21]。第3類群為滿山紅、錦繡杜鵑和皋月杜鵑，同屬映山紅亞屬，表明同一亞屬間的品種親緣關(guān)系較近。

杜鵑花的新品種選育一直都是通過(guò)形態(tài)學(xué)分析測(cè)試來(lái)鑒定和選擇親本，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，可在分子水平上快速準(zhǔn)確的分析親緣關(guān)系，選擇出遺傳多樣性豐富的親本。本研究運(yùn)用RAPD技術(shù)，對(duì)8個(gè)品種的杜鵑花進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，試驗(yàn)結(jié)果可為山西省杜鵑花的分類鑒定和遺傳育種提供分子水平的理論依據(jù)。