童星，彭勃

(1.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

醬油是以大豆、面粉等糧食作物為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造而成具有獨(dú)特色、香、味的傳統(tǒng)調(diào)味品。目前，我國醬油每年生產(chǎn)量超過600萬噸，約占世界總產(chǎn)量的60%[1]。醬油中已發(fā)現(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)超過300種，主要為多肽、氨基酸、低聚糖、脂肪酸、甘油以及各種有機(jī)酸與醇類經(jīng)酯化生成的酯類等。韋氏辭典中對風(fēng)味的定義為“所嘗到的、嗅知的和觸知的口中食物的總體感受”。醬油風(fēng)味即為醬油的香味、滋味等，風(fēng)味的形成需要在具體釀造過程中使曲霉、耐鹽酵母和細(xì)菌在發(fā)酵過程中協(xié)同作用[2]。醬油的風(fēng)味物質(zhì)復(fù)雜而平衡，獨(dú)具特色，對醬油風(fēng)味物質(zhì)的研究是當(dāng)前調(diào)味品行業(yè)中的熱點(diǎn)。

1 醬油風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)

醬油中的風(fēng)味物質(zhì)來源十分復(fù)雜，是原料中的營養(yǎng)成分經(jīng)過一系列發(fā)酵或酶解的作用而產(chǎn)生的各級分解物，以及這些產(chǎn)物之間發(fā)生進(jìn)一步的生物化學(xué)反應(yīng)從而得到的產(chǎn)物，其涉及的過程主要包括以下幾種。

1.1 通過蛋白質(zhì)降解作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)

醬油在釀造過程中，需要用到大豆或豆粕以及小麥等糧食作物作為原料，這些原料中含有豐富的蛋白質(zhì)，經(jīng)過高溫煮制后，原料中的蛋白質(zhì)被破壞，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時經(jīng)過米曲霉等微生物分泌的蛋白酶的作用發(fā)生降解，降解產(chǎn)物包括多肽、寡肽和氨基酸，這些分解產(chǎn)物不僅能夠帶來鮮味，有的還能為醬油的風(fēng)味提供濃厚感[3]。氨基酸類物質(zhì)常常具有多種風(fēng)味功能，是醬油風(fēng)味中最重要的貢獻(xiàn)者之一，例如：Ala，Gly，Ser，Thr，Lys等氨基酸具有甜味作用；而Arg，His，Phe，Leu等氨基酸則帶有苦味。蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物不僅是醬油中主要的滋味物質(zhì)，也對醬油的揮發(fā)性氣味有著重要的意義，因?yàn)樗鼈兂３Ｄ軌虺蔀閾]發(fā)物質(zhì)的前體物質(zhì)[4]。

1.2 通過淀粉的糖化作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)

醬油制曲過程中的重要微生物米曲霉能夠在制曲階段分泌多種酶類，其中包括液化酶(α-淀粉酶)與糖化酶(葡萄糖苷酶)這2種重要的淀粉酶。這2種淀粉酶分別針對淀粉鏈的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵進(jìn)行切除，在這些酶類的作用下，原料中的淀粉類物質(zhì)能夠被逐步水解為小分子的葡萄糖[5]。在米曲霉生長的過程中，原料中的淀粉開始分解但并不完全，直到發(fā)酵階段，大量的淀粉酶經(jīng)微生物代謝而產(chǎn)生，使淀粉繼續(xù)糖化，生成多種小分子碳水化合物，如葡萄糖、麥芽糖和糊精等。淀粉糖化所產(chǎn)生的糖類物質(zhì)，使醬油具有一定的甜味，并且這些糖分成為制曲及發(fā)酵過程中微生物生長的碳源，是醬油微生物發(fā)酵的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，碳水化合物是美拉德反應(yīng)中的必需化合物之一，這就為醬油風(fēng)味、色澤、體態(tài)的形成奠定了基礎(chǔ)[6]。

1.3 通過脂肪的水解作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)

黃豆等原料中都含有大量的油脂，這些油脂可能會在發(fā)酵過程中發(fā)生酸敗，從而導(dǎo)致不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，但同時油脂的分解也會對醬油的香氣做出貢獻(xiàn)。油脂在制曲過程中可以被米曲霉所分泌的脂肪酶所降解，產(chǎn)生脂肪酸等物質(zhì)。脂肪酸本身對香氣并沒有太大作用，但經(jīng)過長達(dá)半年的發(fā)酵后，能夠被氧化成一系列脂肪酸鏈等化合物，再經(jīng)過進(jìn)一步的化學(xué)反應(yīng)，最終生成醛類、酮類、酯類等具有香氣的物質(zhì)。其次，油脂降解生成的各種脂肪酸與醬醪中的酵母發(fā)酵產(chǎn)物乙醇作用生成各種小分酯類，酯類具有芳香香氣[7]。

1.4 通過其他菌種的代謝作用產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)

酵母菌和乳酸菌在醬油發(fā)酵中、后期代謝活躍，其中酵母菌如釀酒酵母和魯氏酵母等能夠分泌酒化酶，該類酶系的主要作用是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳。在醬醪中，部分葡萄糖在酒化酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化，同時產(chǎn)生一系列副產(chǎn)物。酒化作用后生成的乙醇，能夠繼續(xù)被氧化為酸類，部分進(jìn)一步反應(yīng)為酯類，此類物質(zhì)是醬油香氣的重要組成部分，另一部分繼續(xù)殘留在醬油中。此外，醬油中還有一些通過氨基酸脫羥基、氨基而形成的戊醇、丁醇等醇類物質(zhì)，它們也具有一定的呈味作用，并且同樣具有酯化反應(yīng)的潛能。這些物質(zhì)是醬油風(fēng)味的有效增強(qiáng)劑，不僅能夠緩解咸味，還使醬油的口感變得更加柔和、濃郁。

2 醬油風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展

發(fā)酵醬油的風(fēng)味能夠受到多種因素的影響，包括原料類型、發(fā)酵菌種、工藝條件等。隨著研究水平的不斷提高，近年來人們開始結(jié)合人體感官評價、分子層面研究以及人工智能分析，以達(dá)到對風(fēng)味更加深入的探究效果。

2.1 醬油中香氣物質(zhì)的分析

類似于其他食品的風(fēng)味，醬油的風(fēng)味也包括香氣和滋味2個重要因素。香氣主要是在其發(fā)酵中形成的，這些揮發(fā)性物質(zhì)相互平衡，成為醬油中特征香氣的主要來源。

1961年，Yokotsuka等[8]首次在醬油中發(fā)現(xiàn)風(fēng)味化合物4-乙基愈創(chuàng)木酚，并且將該物質(zhì)作為醬油風(fēng)味成分的指標(biāo)。Nunamura等[9-11]于1978～1984年在深入探究醬油風(fēng)味時，對其風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了簡單的分類，即分為93種酸性物質(zhì)、35種堿性物質(zhì)和142種中性物質(zhì)。Petra等人[12]對日本市售醬油的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，利用香味提取稀釋分析(Aroma Extract Dilution Analysis，AEDA)定量分析，得到多種具有高稀釋因子的活性風(fēng)味物質(zhì)，其中2-苯乙醇的風(fēng)味稀釋因子高達(dá)4096，3-甲硫基丙醛、4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)等物質(zhì)的風(fēng)味稀釋因子為1024。同時還研究了熱處理對醬油風(fēng)味物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)熱處理后HEMF和HDMF等物質(zhì)含量增加，醬油的整體香氣發(fā)生變化。

國內(nèi)也有很多研究者對醬油中的風(fēng)味物質(zhì)及其形成機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。熊芳媛等[13]提取了老抽醬油中的風(fēng)味成分，并通過氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)分離鑒定其化學(xué)組成，共鑒定出55種化合物，其中3,8-二羥基-2-甲基色酮等7種物質(zhì)對老抽風(fēng)味成分的貢獻(xiàn)最大。張艷芳等[14]用固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)結(jié)合GC-MS對低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油和高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，共鑒定了52種物質(zhì)；具有蘑菇香氣的1-辛烯-3醇等17種成分為低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油所特有；9種成分為高鹽固態(tài)發(fā)酵醬油所特有。

近幾年，通過人工智能結(jié)合的方式研究醬油香氣物質(zhì)的研究不斷加深。日本的Kaori等[15]通過氣相色譜-嗅覺辨別法(Gas Chromatography-Olfactrometry，GC-O)對醬油的風(fēng)味成分進(jìn)行分析，檢測到28種活性風(fēng)味物質(zhì)，再利用氣體提取物稀釋分析(Aroma Extraction Dilution Analysis，AEDA)方法，發(fā)現(xiàn)了醬油中的幾種高風(fēng)味稀釋因子物質(zhì)，包括HEMF、3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇等。Meng Qi等[16]通過GC-O測定生醬油和熱處理醬油的香氣物質(zhì)，對香氣物質(zhì)的分類見表1。其中乙基-2-甲基丙酸酯、丁酸乙酯、乙基-2-甲基丁酸酯、乙基-3-甲基丁酸酯和乙基-4-甲基戊酸酯比其他芳香化合物具有較高的風(fēng)味稀釋因子。

表1 GC-O分析中揮發(fā)性化合物分類

總體來看，國內(nèi)外對醬油香氣成分的研究較多，近300種揮發(fā)性風(fēng)味化合物已經(jīng)被分離、鑒定，并確定HEMF、4-乙基愈創(chuàng)木酚、3-甲硫基丙醇等為關(guān)鍵醬香物質(zhì)。

2.2 醬油中滋味物質(zhì)的分析

醬油的滋味以咸鮮味為主，并略帶有甜、酸等味道的復(fù)合體系。游離氨基酸、水溶性肽以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等是醬油的主要呈味物質(zhì)。

20世紀(jì)80年代，Tomita等[17]首次發(fā)現(xiàn)米曲霉產(chǎn)生的谷氨酰胺酶能催化L-谷氨酰胺和氨基酸(或肽)間的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。因此，將這種谷氨酰胺酶添加到醬油發(fā)酵模型中能顯著降低醬油中谷氨酰胺和焦谷氨酸的含量，并增大谷氨酸和γ-谷氨酰肽的濃度，增強(qiáng)醬油的鮮味。

21世紀(jì)初，Lioe等[18]對日本市場上流行的3種醬油(Koikuchi，Tamari，Shiro)的成分進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)甜味氨基酸、鈉鹽和谷氨酸是這3種醬油中的主要呈味物質(zhì)，而通過對醬油鮮味物質(zhì)的深入研究[19-21]，發(fā)現(xiàn)醬油鮮味基本上來源于分子量少于500 Da的超濾部分；閾下濃度的L-α-芳香簇氨基酸(L-Phe, L-Tyr)與MSG/NaCl、MSG/IMP、MSG/GMP協(xié)同作用可提升醬油的鮮味。

近幾年，Kaneko等[22]運(yùn)用多級色譜從醬油中分離鑒定出5個化合物： Fru-pGlu，F(xiàn)ru-Val，F(xiàn)ru-Met，pGlu-Gln，pGlu-Gly。味覺實(shí)驗(yàn)表明它們本身無明顯鮮味，但能顯著提升0.6 mmol/L谷氨酸的鮮味，味值由1.1提升至2.5；將此5種化合物加到重建醬油中，重建醬油的鮮味值由2.8提升到3.2。Frerot等[23]運(yùn)用UPLC-MS/MS從醬油中新鑒定出pGlu-Asp，pGlu-Val，Lac-Glu 3個谷氨酸衍生物。2014年，Shiga等[24]通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)醬油中普遍存在一種比MSG和IMP鮮味更強(qiáng)的化合物Fru-Glu。王丹丹等[25]采用電子舌技術(shù)和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對醬油的滋味進(jìn)行了評價和分析，發(fā)現(xiàn)市售的生抽醬油風(fēng)味差異較大，尤其是咸味和酸味，而在苦味和澀味上差異較小，同時經(jīng)過一系列分析發(fā)現(xiàn)，草酸的含量能夠在一定程度上影響生抽醬油的風(fēng)味。相對于醬油揮發(fā)性香味物質(zhì)來說，分子水平的滋味研究比較滯后，特別是有關(guān)醬油的小分子呈鮮味化合物研究正處在迅猛發(fā)展階段。

2.3 醬油發(fā)酵過程中的風(fēng)味物質(zhì)變化

醬油的釀造過程漫長而復(fù)雜，常常達(dá)到6個月以上，通過對醬油釀造過程進(jìn)行追蹤，能夠有效研究其風(fēng)味變化的規(guī)律。目前這部分的研究相對較少，但也有部分研究者以醬油整個釀造過程中的風(fēng)味物質(zhì)變化為線索，探究其物質(zhì)變化的規(guī)律。

Young等[26]用對韓國的傳統(tǒng)發(fā)酵醬油釀造過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)了62種物質(zhì)風(fēng)味物質(zhì)。在發(fā)酵初期，主要產(chǎn)生醇類、酮類、吡嗪類等物質(zhì)，而酸類物質(zhì)和醛類物質(zhì)在初期的含量較少，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行而不斷增加。高獻(xiàn)禮，等[27]以GC-MS鑒定比較了中國傳統(tǒng)釀造醬油在發(fā)酵5～150天的期間內(nèi)醬醪中的風(fēng)味物質(zhì)變化，同時比較了發(fā)酵期為150天醬油在80 ℃下分別加熱30 min和60 min后風(fēng)味物質(zhì)的變化，隨著發(fā)酵期的延長和加熱(80 ℃/60 min)，醇類、醛類和酮類的醇味、焦糖味有明顯的減少，呋喃酮類和苯酚類以及含硫化合物則有輕微的增多。

2.4 醬油風(fēng)味的改善

根據(jù)醬油風(fēng)味的眾多影響因素，可以通過菌種改造、原料配比等方式對醬油的風(fēng)味進(jìn)行探究，通常操作簡便，可行性強(qiáng)，已有眾多成果應(yīng)用于醬油生產(chǎn)中。

早在1984年，Sugiyama等[28]對醬油中的常用發(fā)酵菌種米曲霉(A.oryzae)、醬油曲霉(A.sojae)、耐鹽乳酸菌(P.halophilus)、耐鹽酵母菌(S.rouxii，C.versatilis)等對醬油風(fēng)味的影響進(jìn)行了探討，并確定了發(fā)酵菌株的最佳培養(yǎng)條件，使醬油達(dá)到最佳風(fēng)味。李荔等[29]研究了在產(chǎn)酶能力上具有互補(bǔ)性能的米曲霉和醬油曲霉，結(jié)果表明：米曲霉Aspergillussojae125的谷氨酰胺酶是AS3.042的1.48倍，2個菌株最佳的復(fù)合比例為4∶1，與3.042菌株單獨(dú)制曲相比，氨基氮生成率提高5.37%，L-谷氨酸生成率提高25.41%，醬油風(fēng)味質(zhì)量得到明顯提升。

近年來，也有一些研究者通過在醬油中添加其他菌種來改善醬油的風(fēng)味。Thin等[30]對泰國醬油進(jìn)行了研究，將魯氏酵母和季也蒙畢赤酵母接種在醬油釀造初期，并且對醬醪用SPME-GC-MS等方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在接種以上2種酵母的醬醪中，醇類、酯類、呋喃酮、苯甲酸、麥芽酚等重要風(fēng)味物質(zhì)的含量更高。楊希飛等[31]在發(fā)酵過程中添加嗜鹽四聯(lián)球菌，發(fā)現(xiàn)添加106cfu/mL的嗜鹽四聯(lián)球菌能夠改善醬油風(fēng)味，使揮發(fā)性物質(zhì)種數(shù)和總量上比對照組有明顯增加。戚晨晨等[32]在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵的不同時間添加耐鹽乳酸菌，發(fā)現(xiàn)對醬油中風(fēng)味物質(zhì)含量的影響較大，在45天添加乳酸菌的醬油樣品中，總酸和無鹽固形物的含量明顯提高，含有豐富的風(fēng)味物質(zhì)，而在30天添加則效果相差得多。

很多研究者對醬油的發(fā)酵原料進(jìn)行了優(yōu)化，除了更換現(xiàn)有原料之外，還可以通過適當(dāng)?shù)奶厥馓幚砀淖冊献陨淼男再|(zhì)，最終對醬油的風(fēng)味造成影響。Zhang等[33]對原料中的豆粕進(jìn)行膨化處理，使用HS-SPME和GC-MS等技術(shù)，對醬油中揮發(fā)物化合物進(jìn)行鑒別，結(jié)果在膨化豆粕原料醬油(EMSF)中檢測出40種揮發(fā)性化合物，而普通混合原料醬油(CMSF)中只檢測出了24種，且膨化豆粕原料發(fā)酵的醬油中各氨基酸含量普遍增加，具體見表2。經(jīng)研究，大豆經(jīng)膨化處理后能夠具有海綿狀組織，增加發(fā)酵菌種與原料的接觸面積，有利于菌子的生長附著，有效提高原料的利用率，使成曲獲得更高的酶活力。

表2 氨基酸含量分析

另外，也有些研究者直接在醬油發(fā)酵原料中添加酶類等添加物，以提高醬油的風(fēng)味水平。例如，Kijima等[34]從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中提取出具有谷氨酰胺酶活性并且耐鹽的谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶，并將其加入到醬醪的發(fā)酵中，明顯提高了醬油的鮮味。楊明泉等在醬醪發(fā)酵過程中添加0.05%的酵母抽提物可顯著提高醬油原油的氨基酸態(tài)氮含量，醬油中鮮味氨基酸和苦味氨基酸的相對含量增加，甜味氨基酸的相對含量降低，醬油原油的鮮味和甜味增加。劉通訊等[35]在醬油中復(fù)合添加酵母抽提物和大豆呈味肽，結(jié)果顯示酵母抽提物和大豆呈味肽按3∶2的配比添加至醬油中，醬油風(fēng)味最佳，其鮮味和協(xié)調(diào)性得到了明顯改善。

3 展望

總體來說，近年來人們對于醬油中風(fēng)味物質(zhì)已經(jīng)有了較多的研究，已開發(fā)出多種菌種、原料等優(yōu)化醬油風(fēng)味的工藝條件，并且對揮發(fā)性香氣物質(zhì)以及呈鮮味物質(zhì)的變化規(guī)律具有一定的認(rèn)識，尤其是近10年來人工智能技術(shù)的加入，與GC-MS、HS-SPME等大型精密儀器聯(lián)合使用，能夠十分準(zhǔn)確地定位各呈味物質(zhì)的作用與分子結(jié)構(gòu)，這也體現(xiàn)了未來食品中風(fēng)味物質(zhì)研究的發(fā)展趨勢。然而，在醬油滋味的研究中，電子舌等人工智能感官系統(tǒng)的結(jié)合應(yīng)用仍然較少，這與這項(xiàng)技術(shù)的眾多不可控性有關(guān)，若能將味覺、嗅覺等多項(xiàng)人工智能技術(shù)與微生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)、發(fā)酵工程等多學(xué)科聯(lián)合運(yùn)用，不僅能夠更加系統(tǒng)地了解醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的風(fēng)味規(guī)律，減少發(fā)酵生產(chǎn)中的不可控因素，也能夠廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，為其他方面的研究提供重要基礎(chǔ)。