周龍，劉春燕，董凱向，王包珊，方海龍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.吐魯番現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)中心，新疆高昌區(qū) 838000)

0 引 言

【研究意義】葉片黃化作為葡萄栽培中一種普遍發(fā)生的生產(chǎn)病害，近年來(lái)在吐魯番地區(qū)葡萄栽培管理中時(shí)有發(fā)生。果樹(shù)葉片黃化的誘因很多，這種病害并不是由于果樹(shù)被某些病菌侵染,而是生理性黃化病害。生理性黃化會(huì)表現(xiàn)在內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)上，而葉片作為植物進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)最為敏感的器官，其葉片厚度、柵欄組織厚度及海綿組織厚度等形態(tài)結(jié)構(gòu)上發(fā)生適應(yīng)性變化均是由黃化導(dǎo)致[1,2]。針對(duì)葉片表現(xiàn)出的黃化癥狀，及時(shí)分析樹(shù)體的營(yíng)養(yǎng)特征，對(duì)矯治黃化果樹(shù)具有實(shí)際意義。【前人研究進(jìn)展】李曉燕等[3]研究不同葡萄品種間組織解剖構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)葡萄抗寒砧木類型比栽培品種根、枝條的木質(zhì)部導(dǎo)管體積小、數(shù)量多；葡萄葉片柵欄組織厚度占葉片厚度比率較大，海綿組織細(xì)胞較小，反映了葡萄抗寒砧木抗性強(qiáng)的特點(diǎn)。吳樹(shù)彪等[4]比較不同樹(shù)齡、不同品種蘋(píng)果缺鐵及正常葉片的解剖構(gòu)造，發(fā)現(xiàn)缺鐵葉柵欄組織細(xì)胞排列疏松、外形為較短的念珠狀，葉綠體對(duì)番紅呈負(fù)反應(yīng)，正常葉則相反。Ranferi等[5]研究缺鐵性黃化對(duì)墨西哥酸橙葉片形態(tài)等造成的影響，發(fā)現(xiàn)缺鐵黃化使葉片解剖結(jié)構(gòu)及葉片K，F(xiàn)e，Mn，F(xiàn)e2+含量，P/Fe和K/Ca均受到顯著影響。潘學(xué)軍等[6]比較4種野生葡萄品種的葉片解剖組織，發(fā)現(xiàn)耐旱性強(qiáng)的葡萄品種葉片厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度及葉片組織緊密度(CRT)差異較小?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】吐魯番地區(qū)出現(xiàn)葡萄黃化病，且黃化面積呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，影響葡萄生產(chǎn)收入。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)葡萄黃化病雖然已經(jīng)進(jìn)行大量研究，但多數(shù)集中在葡萄黃化與土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性及葡萄生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的研究，而黃化對(duì)葡萄枝葉解剖結(jié)構(gòu)及葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)差異的研究依然缺乏[7]。研究黃化病對(duì)葡萄枝葉形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)及葉片礦質(zhì)元素的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)測(cè)定葡萄正常株和黃化株枝葉解剖結(jié)構(gòu)和葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)等特性，分析黃化對(duì)葡萄葉片發(fā)育的影響，旨在外觀診斷的基礎(chǔ)上對(duì)葡萄葉片進(jìn)行更細(xì)微的觀察，為葡萄黃化診斷分析和防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試品種為吐魯番勝金鄉(xiāng)色格孜庫(kù)勒村葡萄黃化園無(wú)核白和無(wú)核白雞心，葡萄園樹(shù)齡8 a以上，傾斜式小棚架栽培，株行距為4 m×4.5 m。葡萄黃化病的程度劃分4個(gè)等級(jí)，參考晁無(wú)疾[8]的方法，將試驗(yàn)地葡萄新梢葉片的黃化程度依次分為正常葉(CK)、輕度黃化葉、中度黃化葉和重度黃化葉。

在兩種葡萄黃化園和正常園中選擇4個(gè)果園，每個(gè)園內(nèi)隨機(jī)選擇3株，將每個(gè)植株從架上、架中、架下3個(gè)方位分別采摘不同黃化等級(jí)的葉片50片，每級(jí)共150片葉，用硅膠干燥保存，并貼上標(biāo)簽帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。圖1

圖1 葡萄葉片的黃化程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
Fig.1 Grading standard of yellow degree of grape leaves

1.2 方 法

1.2.1 葉綠素含量測(cè)定

于2017年6月進(jìn)行，試驗(yàn)分別采取手持SPAD-502葉綠素儀測(cè)定法和丙酮研磨法[9]進(jìn)行測(cè)定。

SPAD-502葉綠素儀測(cè)定法：各選取葡萄園正常株和黃化株一年生新梢枝條上第4～5片葉，向陽(yáng)且無(wú)病蟲(chóng)害及無(wú)機(jī)械損傷的完整葉片，每個(gè)葉片再取從里到外3個(gè)點(diǎn)。并在當(dāng)日使用便攜式SPAD-502葉綠素儀測(cè)定葉片SPAD值。不同黃化程度的葡萄葉片均測(cè)定10片，將SPAD值計(jì)算平均值。

丙酮研磨法：即將樣本葉片剪碎、磨漿，用80%的丙酮溶液提取，過(guò)濾后定容，分別在645、652和663 nm下測(cè)定光密度值，每組處理3個(gè)重復(fù)。葉綠素含量(mg/L)=色素濃度(C)×提取液體積(ml)×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重(g)

1.2.2 莖和葉片組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致且在架蔓中部枝條第4～5節(jié)位的葉片及莖段。每個(gè)品種根據(jù)不同黃化程度各采集5片葉和5節(jié)莖段，用標(biāo)準(zhǔn)固定液(FAA液)固定，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入4℃冰箱中進(jìn)行保存。

采用石蠟切片試驗(yàn)對(duì)葡萄莖段及葉片組織進(jìn)行顯微組織結(jié)構(gòu)觀察，切片厚度為10～12 μm，用番紅固綠染色，中性樹(shù)膠進(jìn)行封片[10]。用Motic Type102M顯微成像系統(tǒng)觀察、拍照，用Motic Image Plus 2.0圖像分析軟件測(cè)量葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度等指標(biāo)；莖段測(cè)量主要是木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度、髓厚度等。每個(gè)品種每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定10組數(shù)據(jù)。

1.2.3 葉片營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定

葉片全N采用H2SO4-H2O2消煮定氮法測(cè)定，全P采用H2SO4-H2O2消煮分光光度法，全K采用H2SO4-H2O2消煮火焰分光光度法，全Fe和全Mg采用HNO3-HClO4消煮原子吸收分光光度法，采用干灰化法測(cè)定灰分含量，即將葉片置入馬福爐中經(jīng)過(guò)550℃灰化5 h后測(cè)定其灰分含量，單位為%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Tukey’s多重比較，比較正常葉片和黃化葉之間指標(biāo)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃化程度對(duì)葡萄葉片葉綠素含量的影響

葉綠素作為植物光合色素中是尤為重要的，其含量的多少將受逆境的脅迫而下降[11]。葡萄正常株和黃化株葉片葉綠素含量間達(dá)到顯著差異。隨著葡萄不同黃化程度的加劇，葉片SPAD值和葉綠素a、b和a+b含量逐漸降低。無(wú)核白正常葉SPAD值和葉綠素a+b含量分別是重度黃化葉10.56倍和5.70倍。而無(wú)核白雞心正常葉SPAD值和葉綠素a+b含量分別是35.91倍和2.51倍。表1

表1 不同黃化程度葡萄葉片SPAD值和葉綠素含量測(cè)定Table 1 Determination of leaf SPAD units and chlorophyll content in grape leaves with different degrees of chlorosis

注：同列數(shù)據(jù)后小寫(xiě)表示經(jīng)Tukey法多重比較在0.05水平差異顯著，下同
Notes: Same column data lowercase letters representing the same method by Tukey multiple comparisons at the 0.05 level difference was not significant．The same as below

2.2 不同黃化程度對(duì)葡萄莖、葉片形態(tài)與解剖特性的影響

2.2.1不同黃化程度對(duì)葡萄枝葉生長(zhǎng)量的影響

黃化對(duì)葡萄的新梢節(jié)間、葉片的生長(zhǎng)影響較為顯著。隨著不同黃化程度的加重，黃化株葡萄的新梢節(jié)間粗、新梢節(jié)間重、葉長(zhǎng)和葉寬均與正常株無(wú)顯著差異，而黃化株新梢節(jié)間長(zhǎng)、葉重及單葉厚均顯著低于正常株。無(wú)核白正常株的新梢節(jié)間長(zhǎng)、葉重及單葉厚分別是重度黃化株的1.30、1.38、1.35倍；無(wú)核白雞心正常株的新梢節(jié)間長(zhǎng)、葉重和單葉厚分別是重度黃化株的1.23、1.80、3.54倍。表2

表2 不同黃化程度下葡萄枝葉生長(zhǎng)量變化Table 2 Effects of different degrees of Chlorosis on the growth of grape branches and leaves

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 (P<0.05)，下同
Note:Mean±SD.The date in the same column table followed by different lowercase letter indicate significantly difference at 0.05 level.The same as below

2.2.2 不同黃化程度對(duì)葡萄莖解剖結(jié)構(gòu)的影響

研究表明，正常株和黃化株莖段橫切面解剖結(jié)構(gòu)存在差異不顯著。圖中莖部橫切面呈橢圓形，表皮細(xì)胞為1層，細(xì)胞體積小且排列緊密，角質(zhì)層厚度較薄。外皮層是表皮層內(nèi)部厚角組織細(xì)胞和薄壁細(xì)胞組成，排列分別為2～3層和5～6層，細(xì)胞體積小且排列較為松散。橫切面中央是維管柱，外韌型維管組織，木質(zhì)部和韌皮部排列呈環(huán)狀分布，二者中有明顯形成層帶。維管束排列整齊，束間由3～5層的髓射線相分離。莖中間髓部發(fā)達(dá)，莖的中心由大量的薄壁細(xì)胞組成，胞間隙較小。圖2

注：無(wú)核白(A.正常；B.輕度黃化；C.中度黃化；D.重度黃化)；無(wú)核白雞心(E.正常；F.輕度黃化；G.中度黃化；H.重度黃化)Pi.髓；Xy.木質(zhì)部；Ph.韌皮部；Vr.木射線，標(biāo)尺為100 μm
Note:Thompsonseedless(A.Normal；B.Light chlorosis; C.Middle chlorosis; D.Severe chlorosis);Centennialseedless(E.Normal; F.Light chlorosis; G.Middle chlorosis; H.Severe chlorosis) Pi.Medullary; Xy.Xylem；Ph.Phloem; Vr.xylem ray,The ruler is 100 μm

圖2 不同黃化程度葡萄莖橫切面顯微結(jié)構(gòu)觀察(×10)
Fig. Observation on Microstructure of grape stem transverse section with different degrees of chlorosis(×10)

研究表明，隨著黃化程度的不斷加深，葡萄莖段內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在明顯差異。無(wú)核白正常株莖的木質(zhì)部厚度、木質(zhì)部厚度與韌皮部厚度比均比重度黃化株分別增厚58.33%和55.91%，而韌皮部厚度、髓厚度沒(méi)有明顯差異。無(wú)核白雞心正常株分別比黃化株木質(zhì)部厚度、髓厚度及木質(zhì)部厚度/韌皮部厚度增厚了32.14%、56.20%和28.92%，而韌皮部厚度差異不顯著。表3

表3 不同黃化程度下葡萄莖解剖結(jié)構(gòu)變化Table 3 Effects of different degrees of Chlorosis on the anatomical structure of grape stems

2.2.3 不同黃化程度對(duì)葉肉組織結(jié)構(gòu)的影響

無(wú)核白葉片A-D和無(wú)核白雞心葉片E-H所示為葡萄的葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)，兩種葡萄正常植株葉片葉綠體數(shù)量較多，且排列緊密，尤其是橫切面上部?jī)蓪优帕械挠?～3層呈圓柱形的柵欄組織細(xì)胞組成；海綿組織細(xì)胞較大且排列較為密集。在重度黃化后，細(xì)胞長(zhǎng)度和數(shù)量均顯著低于正常葉，柵欄組織厚度變?yōu)樵瓉?lái)的一層，細(xì)胞外部形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則塊狀，甚至有些出現(xiàn)斷裂狀態(tài)，葉綠體數(shù)量少且細(xì)胞排列較為松散；而海綿組織細(xì)胞排列也極其疏松，細(xì)胞數(shù)量較少，柵欄組織與海綿組織界限較為模糊，整個(gè)葉肉組織變薄。圖3

注：無(wú)核白葉肉組織(A.正常；B.輕度黃化；C.中度黃化；D.重度黃化)；無(wú)核白雞心葉肉組織(E.正常；F.輕度黃化；G.中度黃化；H.重度黃化)a.上表皮；b.下表皮；c.柵欄組織；d.海綿組織
Note:Thompsonseedless(A.Normal; B.Light chlorosis; C.Middle chlorosis; D.Severe chlorosis);Centennialseedless(E.Normal; F.Light chlorosis; G.Middle chlorosis; H.Severe chlorosis) a.Upper-epidermis; b.Lower-epidermis; c.Palisade tissue; d.Spongy tissue

圖3 不同黃化程度葡萄葉肉組織結(jié)構(gòu)觀察
Fig.3 Observation on the structure of grape mesophyll with different degrees of yellowing

研究表明，隨著葡萄葉片黃化程度的不斷加深，葉片變薄，葡萄正常株與黃化株葉肉組織結(jié)構(gòu)特征之間呈顯著差異。兩種葡萄正常株葉片厚度比黃化株分別增厚了20.93%和39.17%，無(wú)核白重度黃化葉上、下表皮厚度分別只有正常葉的94.11%和38.78%，但不同黃化程度間葡萄葉片上、下表皮厚度達(dá)到不顯著差異。兩種葡萄重度黃化葉片的柵欄組織厚度和海綿組織厚度僅僅比正常株葉片分別降低了18.94%、46.81%和126.02%、38.43%。無(wú)核白雞心正常葉柵海比與黃化葉呈顯著差異，黃化葉是正常葉的61.84%，而無(wú)核白正常與黃化葉柵海比間差異不顯著。表4

2.3 不同黃化程度對(duì)葡萄葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的影響

葡萄正常株和黃化株葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素達(dá)顯著差異。隨著葡萄葉片黃化程度的加深，兩種葡萄葉片N、Fe、Mg含量呈不斷下降趨勢(shì)，而P、K含量、P/Fe、K/Mg及葉片灰分含量呈上升趨勢(shì)。兩種葡萄正常株葉片N、Mg含量分別比重度黃化葉高31.85%、40.97%和43.08%、40%，而無(wú)核白正常株葉片P、K含量比黃化株葉片分別減少36.51%和51.50%，達(dá)到顯著差異。葉片灰分含量作為植物礦質(zhì)元素的總和，無(wú)核白和無(wú)核白雞心葉片平均灰分含量最小分別為8.13%、8.38%，最大分別為10.85%、11.04%，且無(wú)核白雞心平均灰分含量大于無(wú)核白平均灰分含量。表5

表4 不同黃化程度下葡萄葉片解剖結(jié)構(gòu)變化Table 4 Effect of the degree of chlorosis on leaf anatomical structure

表5 不同黃化程度下葡萄葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)變化Table 5 Effects of different degrees of Chlorosis on mineral nutrition in grape leaves

3 討 論

3.1 不同黃化程度對(duì)葡萄葉片葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，它對(duì)光合作用中光吸收起到關(guān)鍵地位[12]。研究發(fā)現(xiàn)，正常葉SPAD值和葉綠素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黃化葉的葉綠素含量，無(wú)核白正常葉SPAD值和葉綠素a+b含量分別是重度黃化葉的10.56倍和5.70倍。關(guān)于這方面李春霞等[13]研究不同黃化等級(jí)香樟葉綠素含量變化規(guī)律以及黎秀麗等[14]研究庫(kù)爾勒香梨黃化葉片葉綠素含量時(shí)也得出了同樣的結(jié)論。隨著葡萄葉片黃化程度的加重，會(huì)致使葡萄葉片葉綠素含量減少，從而影響了葡萄植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 不同黃化程度對(duì)葡萄莖、葉片形態(tài)與解剖特性的影響

植物莖、葉片的形態(tài)在環(huán)境的變化中具有較高的敏感性和可塑造性，其解剖組織結(jié)構(gòu)的特征變化能表現(xiàn)出植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[15]。研究發(fā)現(xiàn)，兩種葡萄發(fā)生重度黃化時(shí)，葉片柵欄組織厚度與海綿組織厚度分別只有正常葉的84.1%、68.1%和44.2%、72.2%，達(dá)到極顯著差異。關(guān)于這一點(diǎn)張朝紅等[16]研究酥梨的葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度等，發(fā)現(xiàn)隨著黃化程度的加深而變薄，細(xì)胞排列疏松，葉綠體數(shù)量減少，酥梨重度黃化時(shí)葉片柵欄組織為正常葉的61.7%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在形態(tài)解剖上黃化葉較正常葉的葉片柵欄組織和海綿組織排列疏松，細(xì)胞外形為不規(guī)則塊狀甚至斷裂，葉綠體數(shù)量極少，整個(gè)葉肉組織變薄。關(guān)于這一點(diǎn)賈曉紅等[17]對(duì)土沉香進(jìn)行9種缺素處理觀察其葉片表型特征及葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)缺硼對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)造成一定的變異，細(xì)胞排列較為疏松，形狀變化各異，這與研究結(jié)論一致。因此，不同黃化等級(jí)之間兩種葡萄葉片解剖比較研究表明，葡萄外部形態(tài)發(fā)生黃化，均由葉片組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)部細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞變化而控制的[18]。

3.3 不同黃化程度對(duì)葡萄葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)含量的影響

礦質(zhì)元素是植物生長(zhǎng)的必需元素，若植物缺少此類元素易導(dǎo)致植株葉片黃化[19]、生長(zhǎng)勢(shì)衰弱甚至影響植株地上部的產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，兩種葡萄品種黃化葉P、K含量均高于正常葉。關(guān)于這方面，Ranferi等[5]對(duì)不同黃化程度墨西哥酸橙葉片進(jìn)行礦質(zhì)元素分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃化葉P、K含量均超于正常葉礦質(zhì)元素含量值，這與本研究結(jié)果一致。原因可能是根部細(xì)胞礦質(zhì)元素通過(guò)土壤溶液進(jìn)行交換吸附，即H+通過(guò)根部?jī)?nèi)細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP酶進(jìn)行離子交換，利于K+的交換和吸收[21,22]。K+的積累也導(dǎo)致了無(wú)核白雞心K/Mg比值較高(2.13)，且重度黃化值達(dá)5.16。而K+與Mg2+相比較使碳水化合物減少，降低了K+從葉片到韌皮部血管的運(yùn)動(dòng)，甚至在黃化葉片時(shí)停止，從而也減少了生物量的合成[23]。與此同時(shí)，葉優(yōu)良等[24]研究蘋(píng)果、梨、桃葉片營(yíng)養(yǎng)含量的變化，也發(fā)現(xiàn)葉片全P含量呈升高趨勢(shì)，認(rèn)為可能是葉片P含量增高，導(dǎo)致葉片中P/Fe比失調(diào)，從而影響鐵的吸收，使葉片失綠黃化。在進(jìn)行葡萄黃化矯治時(shí)需要注意合理考慮礦質(zhì)元素的平衡施加。

4 結(jié) 論

與正常葉相比，黃化葉SPAD值、葉綠素a+b等含量顯著低于正常葉；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)無(wú)核白正常葉N、Fe、Mg含量分別是黃化葉的1.47、1.90和1.76倍，從葉片解剖結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)黃化葉較正常葉的葉片柵欄組織和海綿組織排列疏松，細(xì)胞外形為不規(guī)則塊狀甚至斷裂，葉綠體數(shù)量極少，整個(gè)葉肉組織變薄。葡萄生理性黃化從枝葉表型特征到微觀解剖結(jié)構(gòu)均有明顯差異，葉片質(zhì)量、葉綠素含量、莖木質(zhì)部厚度、葉柵海比、葉灰分中P、K含量等指標(biāo)的變化對(duì)于判斷葡萄生理性黃化狀況具有重要的參考價(jià)值。