自海云 李琬婷 程小毛 黃曉霞

(西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，國家林業(yè)局西南風(fēng)景園林工程研究中心，云南 昆明 650224)

重金屬近年來受到廣泛關(guān)注[1]。鎘由于其毒性強(qiáng)并極易被植物吸收與積累，是危害最嚴(yán)重的重金屬之一[2-3]。研究表明，鎘會(huì)降低植物體內(nèi)酶的活性[4]及光合強(qiáng)度[5]，改變細(xì)胞膜透性[6]，抑制其對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收等[7-8]。重金屬污染地區(qū)，人為種植耐性強(qiáng)植物，通過其本身的富集作用來積累重金屬而凈化土壤，稱為植物修復(fù)[9]。因此研究不同植物對(duì)重金屬脅迫的耐性及抗性具有重要意義。光合作用中光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ) 是逆境下敏感脆弱的部位之一[10]。重金屬對(duì)植物PSⅡ的影響都可通過植株內(nèi)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)變化反映出來[11]，因此葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)是研究植物光合生理特性及與逆境脅迫相互關(guān)系的理想探針[12]，通過對(duì)這些因素的綜合分析可為不同植物在重金屬脅迫下的耐性機(jī)理研究提供極高參考價(jià)值。

洋常春藤 (Hederahelix) 引種自歐洲，是五加科 (Araliaceae) 常春藤屬 (Hedera) 觀葉常綠藤本植物。由于其生長快，對(duì)環(huán)境因子的要求較低，生態(tài)幅廣，在蔭蔽、土壤瘠薄、干旱、水漬等環(huán)境條件下均能生長良好，因此被廣泛引種應(yīng)用作地被、室外護(hù)坡、邊坡綠化、水土保持等。目前關(guān)于對(duì)洋常春藤的研究，大多集中于藥用[13]、組織培養(yǎng)[14]和扦插繁殖[15]等方面，在其生長速度[16]、光合作用[17]等方面也有少量研究，而關(guān)于洋常春藤抗性方面的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)地被植物洋常春藤進(jìn)行不同濃度鎘脅迫，測(cè)定并分析其葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓闆r，探究鎘脅迫對(duì)其PSⅡ的影響，以期為該植物的推廣應(yīng)用及重金屬污染地區(qū)綠化植物選擇奠定一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2016年4月初選取當(dāng)年生洋春藤半木質(zhì)化枝條扦插于營養(yǎng)袋中，生根后于6月中旬移栽至水培瓶中，選pH值為5.5～6.5，不加蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)液進(jìn)行水培培養(yǎng)，隔天更換1次營養(yǎng)液。所有苗木在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日光照時(shí)長設(shè)定為12 h (光強(qiáng) ≥ 56.6 μmol/(m2·s))，白天/夜間溫度設(shè)定為25/20 ℃，相對(duì)濕度保持在80%。待植株生長達(dá)到平緩穩(wěn)定時(shí)，選取其中長勢(shì)整齊，生長狀況良好的幼苗進(jìn)行鎘脅迫處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取生長一致、生長狀況良好的當(dāng)年生洋常春藤幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，通過在MS培養(yǎng)液中加入不同濃度梯度的CdCl2溶液進(jìn)行處理。根據(jù)前人研究方法[18]以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理組，CK、Cd1、Cd2、Cd3、Cd4，其Cd2+濃度分別為0、20、80、200、400 μmol/L。每處理10瓶重復(fù)，每瓶1株處理時(shí)間為60天。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

處理結(jié)束之后，每株選其從頂部往下葉面完全展開的第3～5枚葉片作為各指標(biāo)待測(cè)定樣品。

1.3.1葉綠素含量的測(cè)定

參照Inskeep與Bloom的方法[18]測(cè)定葉綠素含量。

1.3.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)所使用的儀器是調(diào)制式IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng) (WALZ, Germany)[19]。首先，設(shè)定測(cè)量光強(qiáng) (0.5 μmol/(m2·s)) 測(cè)定初始熒光 (F0)，然后再利用為脈沖2 700 μmol/(m2·s) (脈沖時(shí)間0.8 s) 的飽和光誘導(dǎo)最大熒光產(chǎn)量 (Fm)，其中作用光強(qiáng)度為76 μmol/(m2·s)[20]。把待測(cè)的實(shí)驗(yàn)葉片放置在葉室中，選中多個(gè)直徑1 cm的存在明顯差異的區(qū)域 (AOI)，各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)力學(xué)變化曲線通過軟件的Kinetics窗口檢測(cè)[21]，隨后在Report窗口導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所得到F0、PSⅡ潛在最大光化學(xué)效率 (Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率 (YⅡ)、光化學(xué)淬滅 (qP)、非光化學(xué)淬滅 (qN) 以及電子傳遞速率 (ETR) 等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的計(jì)算，由儀器自動(dòng)輸出[22]。實(shí)驗(yàn)植株測(cè)試之前應(yīng)經(jīng)充分暗適應(yīng) (20～30 min)，測(cè)量時(shí)應(yīng)避免葉片的主脈位于葉室打光的中部，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.4 分析方法

數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)等統(tǒng)計(jì)分析，在利用Ducan′s法多重比較并在Excel表格中繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對(duì)洋常春藤葉片葉綠素含量的影響

鎘脅迫對(duì)洋常春藤葉片葉綠素含量的影響見表1。

由表1可知，與CK比，洋常春藤幼苗葉片在不同濃度鎘脅迫下，葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量均顯著降低 (P< 0.05)，且葉綠素b的降低幅度比葉綠素a的降低幅度更大，促使葉綠素a/b顯著增加 (P< 0.05)。此外，隨著脅迫濃度的增加，葉綠素總量呈下降趨勢(shì)，且在高濃度鎘脅迫Cd4處理下降至最低值。葉綠素b含量在Cd1、Cd2、Cd3、Cd4間無顯著差異。葉綠素a/b在Cd2處理下為最高值，相比較CK上升了34.17%。

表1 鎘脅迫對(duì)洋常春藤葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effects of Cd2+ stress on chlorophyll content of H.helix

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.2 鎘脅迫對(duì)洋常春藤F0的影響

鎘脅迫對(duì)洋常春藤初始熒光的影響見圖1。

圖1鎘脅迫對(duì)洋常春藤F0的影響
Fig.1 Effects of Cd2+stress onF0ofH.helix

鎘脅迫對(duì)洋常春藤葉片初始熒光F0影響顯著 (P< 0.05)。與CK相比，F(xiàn)0在Cd2、Cd3與Cd4處理下呈顯著升高 (P< 0.05)，且隨著鎘脅迫濃度的增加，其升高程度亦增大，且在這3個(gè)組間差異顯著 (P< 0.05)。但其在Cd1處理下，相比CK無顯著差異。而在高濃度鎘脅迫下 (Cd4)，F(xiàn)0由最初的0.070 9升至0.133 9。

2.3 鎘脅迫對(duì)洋常春藤Fv/Fm及YⅡ的影響

鎘脅迫對(duì)洋常春藤Fv/Fm與YⅡ的影響見圖2。

圖2鎘脅迫對(duì)洋常春藤Fv/Fm與YⅡ的影響
Fig.2 Effects of Cd2+stress onFv/Fm>andYⅡofH.helix

與CK相比，F(xiàn)v/Fm及YⅡ隨著鎘脅迫濃度的增加均呈降低趨勢(shì)。Cd1、Cd2的Fv/Fm與CK比較，無顯著差異。Cd3、Cd4的Fv/Fm相對(duì)于CK顯著降低 (P< 0.05)，分別下降了15.77%、25.89%。與CK比較，Cd1、Cd2、Cd3的YⅡ分別下降了5.28%、14.33%、18.53%，但3組間無顯著差異；Cd4的YⅡ顯著降低26.54% (P< 0.05)?？梢钥闯?，Cd4對(duì)Fv/Fm及YⅡ的影響最大，明顯低于CK。

2.4 鎘脅迫對(duì)洋常春藤qP與qN的影響

鎘脅迫對(duì)洋常春藤qP與qN的影響見圖3。

圖3鎘脅迫對(duì)洋常春藤qP與qN的影響
Fig.3 Effects of Cd2+stress onqPandqNofH.helix

隨著鎘脅迫濃度的增加，qN呈先微弱升高后急劇降低的趨勢(shì)，但在Cd1、Cd2、Cd3中與CK無顯著差異，而在Cd4中qN顯著降低 (P< 0.05)，相比CK下降了27.33%。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的鎘脅迫濃度對(duì)qP值無顯著影響，但在4個(gè)不同濃度鎘處理下有一定的變化，qP值大小順序表現(xiàn)為Cd3> CK > Cd1> Cd2> Cd4。可以看出，鎘脅迫下，洋常春藤qP比qN更加穩(wěn)定。

2.5 鎘脅迫對(duì)洋常春藤ETR的影響

鎘脅迫對(duì)洋常春藤光合電子傳遞速率的影響見圖4。

圖4鎘脅迫對(duì)洋常春藤ETR的影響
Fig.4 Effects of Cd2+stress on ETR ofH.helix

隨著鎘脅迫濃度上升，ETR表現(xiàn)為降低趨勢(shì)。與CK比較，Cd1、Cd2、Cd3ETR分別降低了5.29%、14.39%、18.59%，但在3組間差異不顯著；隨著鎘脅迫濃度的進(jìn)一步增加，在Cd4中，ETR急劇下降，與CK相比降低了26.86%，并與其他各組差異顯著 (P< 0.05)。

3 結(jié)論與討論

葉綠素作為光合作用中不可缺少的重要光合色素之一，其含量變化會(huì)直接影響光合作用能力，葉片中葉綠素分子的減少將減弱植物光合作用的能力，進(jìn)一步導(dǎo)致植物的生長發(fā)育緩慢甚至停滯，生物量隨之降低[23]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片中葉綠素分子合成過程受到阻礙，或加快其降解速度[24]。本實(shí)驗(yàn)中，洋常春藤的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量隨著鎘脅迫濃度的增加均顯著降低 (P< 0.05)，在類似的結(jié)果在前人對(duì)浮萍 (Lemnaminor)[25]、丁香蓼 (Ludwigiaprostrata)[26]、草莓 (Fragaria×ananassa)[27]的鎘脅迫研究中也有曾經(jīng)有過報(bào)道。導(dǎo)致葉綠素含量下降的原因可能是鎘抑制了合成葉綠素所需要的酶 (如葉綠素酸脂還原酶) 的活性[28]；或者是鎘脅迫使細(xì)胞中的活性氧大幅增加，更多O2-和H2O2擴(kuò)散至葉綠體，從而促進(jìn)了葉綠素的降解[29]。除此之外，葉綠素a/b值可以作為衡量光合作用是否正常的指標(biāo)之一[30]。本實(shí)驗(yàn)中，與CK相比較，鎘脅迫下葉綠素b的下降程度比葉綠素a更為明顯，且洋常春藤葉綠素a/b比值隨鎘脅迫濃度增加而顯著升高 (P< 0.05)，表明洋常春藤葉片中的葉綠素b比葉綠素a對(duì)鎘脅迫響應(yīng)更為敏感，或是葉綠素a向葉綠素b的轉(zhuǎn)化加快。有研究表明，葉綠素a/b的比值增加，代表著類囊體的垛疊程度加大，能夠緩解光抑制作用的發(fā)生[31]。這種緩解光抑制的現(xiàn)象可能是洋常春藤應(yīng)對(duì)鎘脅迫的一種自我調(diào)節(jié)方式。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是光化學(xué)過程的指示劑，PSⅡ反應(yīng)中心被認(rèn)為是遭受重金屬脅迫的主要目標(biāo)[32]。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)0、Fv/Fm、YⅡ、qN、qP、ETR在鎘濃度20 μmol/L處理中均無顯著變化，表示當(dāng)在濃度小于 20 μmol/L的鎘脅迫下，洋常春藤光合機(jī)構(gòu)未受到傷害，光反應(yīng)依舊正常進(jìn)行。說明洋常春藤對(duì)20 μmol/L的鎘脅迫有著很強(qiáng)的適應(yīng)性。F0表示不參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光輻射部分[33]。隨著鎘脅迫濃度增加，F(xiàn)0呈顯著性變化且表現(xiàn)為升高趨勢(shì) (P< 0.05)，表明洋常春藤在大于20 μmol/L鎘脅迫下，PSⅡ反應(yīng)中心可能出現(xiàn)了可逆的失活或者不易逆轉(zhuǎn)的破壞[34]，導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)一系列的損傷。Fv/Fm與YⅡ是研究PSⅡ反應(yīng)中心利用所捕獲激發(fā)能情況的重要指標(biāo)[35]，可以較直觀的表示植物在逆境情況下受脅迫的程度。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)v/Fm在20、80 μmol/L鎘脅迫下無顯著變化，而在200、400 μmol/L鎘脅迫下顯著降低 (P< 0.05)；YⅡ在小于200 μmol/L的3個(gè)鎘脅迫處理中無顯著變化，而在400 μmol/L鎘脅迫下顯著降低 (P< 0.05)?？赡苁且?yàn)樵?00 μmol/L鎘脅迫時(shí)，洋常春藤PSⅡ反應(yīng)中心受到破壞，導(dǎo)致Fv/Fm顯著下降 (P< 0.05)；當(dāng)脅迫濃度進(jìn)一步加大至400 μmol/L時(shí)，YⅡ顯著降低 (P< 0.05)。說明400 μmol/L的鎘脅迫對(duì)洋常春藤的光化學(xué)效率造成顯著的抑制 (P< 0.05)，從而影響植株正常的生理生長。植物在吸收的光能超過所利用的能量時(shí)，會(huì)啟動(dòng)非光合能量的耗散途徑來耗散過剩的激發(fā)能以保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受傷害[36]。

本實(shí)驗(yàn)中，qN在20、80、200 μmol/L鎘脅迫中略有升高，說明此時(shí)洋常春藤可通過能量耗散機(jī)制來適應(yīng)鎘脅迫的影響；而隨著鎘脅迫的加重，qN顯著降低 (P< 0.05)，可能是在高濃度脅迫下，洋常春藤葉片內(nèi)葉綠素含量降低比較嚴(yán)重，從而導(dǎo)致吸收的光能減少，進(jìn)而引起qN的顯著下降 (P< 0.05)，也可能與此時(shí)光合機(jī)構(gòu)嚴(yán)重受損有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，洋常春藤葉片qP隨鎘濃度的增加呈下降趨勢(shì)。qP降低意味著光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的開放比例以及參與CO2固定的e-減少，導(dǎo)致光合電子傳遞能力減弱，再導(dǎo)致植物碳反應(yīng)受阻，使得光合速率下降[37]。本實(shí)驗(yàn)中ETR的變化與qP的變化基本一致，也再次驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

綜上所述，鎘脅迫下，洋常春藤的葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)均受到顯著影響 (P< 0.05)。其中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量、Fv/Fm、YⅡ、qN、qP、ETR均隨著鎘脅迫濃度的增大而降低，而葉綠素a/b、F0則呈升高的趨勢(shì)。其中洋常春藤的葉綠素a/b、qN的變化是其對(duì)鎘脅迫環(huán)境的一種應(yīng)對(duì)機(jī)制。20、80 μmol/L的鎘脅迫對(duì)洋常春藤光合機(jī)構(gòu)無明顯傷害，200 μmol/L鎘脅迫對(duì)洋春藤PSⅡ有一定影響，而400 μmol/L的鎘脅迫則會(huì)使得葉綠素含量嚴(yán)重減少，光合機(jī)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷。從本研究可以看出，洋常春藤對(duì)鎘脅迫有一定的耐受性，可在鎘脅迫濃度低于200 μmol/L的地區(qū)作為生態(tài)修復(fù)植物進(jìn)行推廣栽種。