李偉業(yè),徐志進(jìn),柳敏海,殷小龍,李凌剛,章霞,油九菊,張川,葉劍英
(1.浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江 舟山 316000;2.浙江華興水產(chǎn)科技有限公司,浙江 舟山 316000)
東海帶魚Trichiurushaumela隸屬于輻鰭魚綱、鱸形目、帶魚科、帶魚屬,俗稱裙帶魚、牙帶、刀魚等。體型側(cè)扁如帶,呈銀灰色,背鰭及胸鰭為淺灰色,帶有較細(xì)小的斑點(diǎn),尾巴呈黑色,頭尖口大,至尾部逐漸變細(xì),身高為頭長的2倍,廣泛分布于中國、朝鮮半島、日本、印度、菲律賓等海域。其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、肉厚刺少、營養(yǎng)豐富,且其烹食之法頗多,是老百姓最喜歡的海鮮之一,與大黃魚、小黃魚和墨魚并稱為中國“四大海產(chǎn)”[1]。
東海帶魚生性兇猛,受到刺激時(shí)反應(yīng)激烈,離水后掙扎跳躍,極易損傷,進(jìn)而死亡,給運(yùn)輸、分篩、注射等操作帶來諸多困難。因此,需要科學(xué)合理地使用麻醉劑,以降低魚體代謝速率,減緩魚體的應(yīng)激反應(yīng),便于生產(chǎn)和試驗(yàn)操作[2]。目前,魚用麻醉劑種類繁多,有丁香酚、MS-222、喹哪啶、CO2等30余種。其中,MS-222因其使用便捷、入麻時(shí)間短、復(fù)蘇快等優(yōu)點(diǎn),成為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的水產(chǎn)麻醉劑,且通過了美國食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)可[3]。
MS-222作為麻醉劑已用于多種魚類的麻醉研究中,如美洲鰣Alosasapidissima[4]、施氏鱘Acipenserschrenckii[5]、半滑舌鰨CynoglossussemilaevisGunther[6]、真鯛Pagrusmajor[7]、孔雀魚Poeciliareticulata[8]和斑馬魚Daniorerio等[9],但使用MS-222對帶魚麻醉目前尚未見報(bào)道。本研究中,使用MS-222對東海帶魚幼魚進(jìn)行了麻醉研究,以期為MS-222在帶魚麻醉上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
本試驗(yàn)于2017年7月在浙江省舟山市水產(chǎn)研究所朱家尖科研示范基地進(jìn)行。試驗(yàn)魚為該所馴養(yǎng)的東海帶魚幼魚,體質(zhì)量為(43.21±0.52)g,肛長為(14.50±0.13)cm,試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于車間水泥池中(4.0 m×4.0 m×1.6 m),試驗(yàn)開始前1 d將幼魚移至試驗(yàn)桶中。試驗(yàn)用水為經(jīng)沙濾、沉淀后的自然海水,試驗(yàn)水溫為(26.0±1.0)℃,鹽度為26,pH為8.4±0.1。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣,溶解氧保持在5 mg/L以上。試驗(yàn)桶為圓形塑料桶(容積900 L),試驗(yàn)水體為600 L,共計(jì)25個試驗(yàn)桶。
麻醉劑MS-222為上海布西化工有限公司生產(chǎn),將其配制成濃度為0.1 g/mL的MS-222母液,試驗(yàn)時(shí)按各試驗(yàn)組濃度將母液稀釋于各組海水中,麻醉劑藥液配制后24 h用完。
1.2.1 麻醉程度和復(fù)蘇過程的行為特征觀察及分期 試驗(yàn)開始前先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),將MS-222設(shè)置10、20、40、60、80、100、120、140、160 mg/L 9個質(zhì)量濃度組,每個濃度組放10尾魚,觀察試驗(yàn)魚的麻醉情況。從預(yù)試驗(yàn)中得知,當(dāng)MS-222濃度達(dá)到80 mg/L以上時(shí),試驗(yàn)魚可達(dá)到麻醉各期。因此,隨機(jī)選取10尾試驗(yàn)魚放入濃度為80 mg/L的MS-222麻醉液中,觀察并記錄魚體在麻醉和復(fù)蘇過程中各時(shí)期的行為特征和呼吸頻率(以1 min魚鰓蓋張合次數(shù)為呼吸頻率值)。麻醉和復(fù)蘇分期參考劉長琳等[2]確定的標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合東海帶魚幼魚自身行為特征。
隨機(jī)從各試驗(yàn)組分別取5尾魚測定呼吸頻率,以5尾魚呼吸頻率的平均值作為試驗(yàn)魚在該麻醉期的呼吸頻率。初始呼吸頻率以試驗(yàn)魚移入試驗(yàn)桶中穩(wěn)定10 min后的呼吸頻率為準(zhǔn),加入MS-222麻醉劑后再測定麻醉各期的呼吸頻率。試驗(yàn)魚進(jìn)入5期后隨機(jī)取5尾魚,放入自然海水中進(jìn)行復(fù)蘇,測定呼吸頻率,以5尾魚呼吸頻率的平均值作為試驗(yàn)魚在該復(fù)蘇期的呼吸頻率。
1.2.2 不同濃度麻醉劑的麻醉程度 試驗(yàn)設(shè)置MS-222為10、 20、40、60、80、100、120 mg/L 7個質(zhì)量濃度組,每個濃度組放10尾魚,每組設(shè)3個平行,觀察試驗(yàn)魚的麻醉情況。測定試驗(yàn)魚6 h內(nèi)在各MS-222濃度下所達(dá)到的最終麻醉程度。
1.2.3 不同濃度麻醉劑的麻醉效果 試驗(yàn)設(shè)置MS-222為80、100、120、140、160 mg/L 5個質(zhì)量濃度組,每個濃度組放10尾魚,每組設(shè)3個平行。記錄魚體麻醉程度達(dá)到4期時(shí)的入麻時(shí)間,隨后將魚體立即從麻醉劑中移出,放入自然海水中復(fù)蘇,記錄復(fù)蘇時(shí)間和成活率。其中,入麻時(shí)間是指魚放入麻醉液,至達(dá)到4 期麻醉程度所需的時(shí)間;復(fù)蘇時(shí)間是指麻醉至4期的魚放入自然海水中完全恢復(fù)正常行為特征所需的時(shí)間。參照Marking等[9]的觀點(diǎn),有效質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)為:魚體在MS-222麻醉液中,3 min內(nèi)麻醉,5 min內(nèi)復(fù)蘇,且在麻醉液中連續(xù)浸浴15 min 后成活率為100%。
1.2.4 不同濃度麻醉劑對血清皮質(zhì)醇和血糖的影響 試驗(yàn)設(shè)置MS-222為20、40、60 mg/L 3個質(zhì)量濃度組,每個濃度組放20尾魚,每組設(shè)3個平行。將試驗(yàn)魚放入各濃度組中,分別在第0、2、4、6 h時(shí)取樣,每次從各試驗(yàn)組取樣3尾。采用斷尾取血法取試驗(yàn)魚血液(斷尾取血時(shí)先擦干魚體表的黏液和水分,用毛細(xì)血管從尾部中間吸取血液,盡量避免組織液的流入),將血液置于1.5 mL離心管中,置于冰箱(4 ℃)中冷藏,靜置4 h分層后,以5000 r/min離心20 min至完全分層,用移液器取上層血清放入離心管中。采用海水魚皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(美國Rapidbio公司)測定皮質(zhì)醇,采用血糖試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定血糖,具體測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。
數(shù)據(jù)分析和處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,并用單因素方差分析法和Duncan法進(jìn)行顯著性分析和多重比較,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示,顯著性水平設(shè)為0.05。
根據(jù)不同麻醉狀態(tài)下試驗(yàn)魚的行為特征,將麻醉程度分為6期。從表1可見:不同麻醉程度下,試驗(yàn)魚的呼吸頻率會出現(xiàn)變化;在2期時(shí),試驗(yàn)魚的呼吸頻率最高,為(179.80±3.49)次/ min;此后試驗(yàn)魚的呼吸頻率逐漸降低,當(dāng)進(jìn)入5期時(shí),試驗(yàn)魚的呼吸頻率降至(110.40±2.07)次/min。
根據(jù)不同復(fù)蘇狀態(tài)下試驗(yàn)魚的行為特征,將復(fù)蘇過程分為4期。從表2可見:不同麻醉程度下,試驗(yàn)魚的呼吸頻率會出現(xiàn)變化;隨著復(fù)蘇程度的增加,試驗(yàn)魚的呼吸頻率逐漸升高,當(dāng)進(jìn)入4期時(shí),試驗(yàn)魚的呼吸頻率為(152.60±3.05)次/min。
表1東海帶魚幼魚麻醉過程分期、行為特征及呼吸頻率
Tab.1Anaestheticstages,behaviorcharacteristicsandbreathfrequenciesofjuvenilelargeheadhairtailTrichiurushaumeladuringanaesthesiaprocess
麻醉過程分期anaesthetic stage行為特征behavior characteristics呼吸頻率/(次·min-1)breath frequency0期(正常期)魚體直立水中,可連續(xù)前行,將魚體側(cè)置,能迅速翻身恢復(fù)到正常游姿,呼吸頻率正常151.80±2.391期(輕度鎮(zhèn)定期)魚體直立水中,不連續(xù)前行,觸覺略失,將魚體側(cè)置,可迅速翻身恢復(fù)到正常游姿,呼吸頻率略加快170.60±3.362期(深度鎮(zhèn)定期)魚體直立水中,幾乎不前行,觸覺喪失,將魚體側(cè)置,可勉強(qiáng)翻身恢復(fù)到正常游姿,呼吸頻率略加快179.80±3.493期(輕度麻醉期)魚體側(cè)游,且偶爾前沖,肌肉張力和平衡感略失,呼吸頻率降低143.60±2.304期(麻醉期)肌肉張力和平衡感喪失,魚體側(cè)臥靜止,呼吸頻率降低但連續(xù)131.40±3.055期(深度麻醉期)魚體側(cè)臥靜止,呼吸不連續(xù)110.40±2.076期(延髓麻醉期)魚體靜止,呼吸停止—
表2東海帶魚幼魚復(fù)蘇過程、行為特征及呼吸頻率
Tab.2BehaviorcharacteristicsandbreathfrequenciesofjuvenilelargeheadhairtailTrichiurushaumeladuringrecoveryprocess
復(fù)蘇過程分期recovery stage行為特征behavior characteristics呼吸頻率/(次·min-1)breath frequency1期魚體側(cè)臥靜止,呼吸恢復(fù)并連續(xù)130.20±1.922期魚體可緩慢側(cè)游,呼吸頻率加快140.80±3.353期魚體側(cè)游,并能直立水中,將魚體側(cè)置,能翻身恢復(fù)到正常游姿,呼吸頻率接近正常147.20±3.54期魚體恢復(fù)到正常游姿,直立水中,可連續(xù)前行,將魚體側(cè)置,能迅速翻身恢復(fù)到正常游姿,呼吸頻率正常152.60±3.05
從圖1可知:隨著MS-222濃度的增加,試驗(yàn)魚最終麻醉程度逐漸增加。當(dāng)MS-222 濃度低于20 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚最終麻醉程度為0期;當(dāng)MS-222濃度為40 mg/L時(shí),大部分試驗(yàn)魚麻醉程度為1期,而少部分試驗(yàn)魚進(jìn)入2期;當(dāng)MS-222濃度為60 mg/L時(shí),大部分試驗(yàn)魚麻醉程度為3期,而少部分魚進(jìn)入4期;當(dāng)MS-222濃度高于80 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚最終麻醉程度均能達(dá)到6期。
圖1 東海帶魚幼魚在不同MS-222質(zhì)量濃度下的最終麻醉程度Fig.1 Final anaesthesia stage of juvenile largehead hairtail Trichiurus haumela under different MS-222 concentrations
注:標(biāo)有不同小寫字母者表示同一指標(biāo)下不同濃度間有顯著性差異(P<0.05),標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)Note: The means with different letters in different concentrations in same index are very significantly different at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences圖2 不同MS-222質(zhì)量濃度下東海帶魚幼魚的入麻時(shí)間、復(fù)蘇時(shí)間及其浸浴15 min后的成活率Fig.2 Induction time,recovery time and survival rate of juvenile largehead hairtail Trichiurus haumela bathed in different MS-222 concentrations for 15 minutes
從圖2可知,隨著麻醉劑質(zhì)量濃度的增加,試驗(yàn)魚的入麻時(shí)間逐漸減少,復(fù)蘇時(shí)間逐漸增加。當(dāng)MS-222濃度為80 mg/L時(shí),入麻時(shí)間為(953±33)s,顯著高于其他濃度組(P<0.05);復(fù)蘇時(shí)間為(142±11)s,與100 mg/L濃度組無顯著性差異(P>0.05),但顯著低于其他濃度組(P<0.05)。當(dāng)MS-222濃度為160 mg/L時(shí),入麻時(shí)間為(32±2)s,顯著低于其他濃度組(P<0.05);復(fù)蘇時(shí)間為(313±21)s,均顯著高于其他濃度組(P<0.05)。當(dāng)MS-222濃度高于120 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚可在3 min內(nèi)進(jìn)入4期麻醉,當(dāng)MS-222濃度低于140 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚可在5 min內(nèi)復(fù)蘇,且復(fù)蘇成活率為100%。參照Marking等[9]的有效質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn),東海帶魚幼魚的有效MS-222濃度為120~140 mg/L。
從圖3可見,在20、40 mg/L MS-222濃度下,試驗(yàn)魚血清皮質(zhì)醇含量隨著麻醉時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢。MS-222濃度為20 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚的血清皮質(zhì)醇含量在4 h時(shí)最高,為(33.23±1.45)ng/mL,且顯著高于其他濃度組(P<0.05);MS-222濃度為40 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚的血清皮質(zhì)醇含量在2 h時(shí)最高,為(31.16±1.95)ng/mL;MS-222濃度為60 mg/L時(shí),試驗(yàn)魚的血清皮質(zhì)醇含量呈逐漸下降的趨勢,在6 h時(shí)試驗(yàn)魚的血清皮質(zhì)醇含量最低,為(22.60±1.48)ng/mL;各濃度組試驗(yàn)魚均在6 h時(shí)血清皮質(zhì)醇含量最低,且各濃度組間無顯著性差異(P>0.05)。
注:標(biāo)有不同小寫字母者表示同一時(shí)間下不同濃度組間有顯著性差異(P<0.05),標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同Note:The means with different letters at the same time are significant differences in different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖3 MS-222濃度對帶魚幼魚血清皮質(zhì)醇水平的影響Fig.3 Effect of different MS-222 concentrations on serum cortisol concentration in juvenile largehead hairtail Trichiurus haumela
從圖4可見:各濃度組魚血糖含量隨麻醉時(shí)間的延長呈逐漸下降的趨勢,均在6 h時(shí)降至最低,分別為(1.13±0.12)、(1.14±0.15)、(1.12±0.11)mmol/L,且各濃度組間無顯著性差異(P>0.05);而在2 h時(shí),20 mg/L濃度組血糖含量顯著高于40、60 mg/L濃度組(P<0.05)。
圖4 MS-222濃度對東海帶魚幼魚血糖水平的影響Fig.4 Effect of different MS-222 concentrations on Glu concentration in juvenile largehead hairtail Trichiurus haumela
MS-222水溶液可以通過魚鰓絲、魚體表的吸收,迅速進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并傳導(dǎo)至神經(jīng)中樞使得活動能力和反射能力受抑制,然后在大腦中積累,麻醉魚表現(xiàn)出呼吸頻率降低、行動遲緩和排泄物減少,MS-222 進(jìn)入魚體后主要積聚在脾臟、肝臟中,而肌肉中含量甚微,在清水中極易從魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移到水中,故MS-222當(dāng)前被廣泛作為水產(chǎn)品生產(chǎn)及試驗(yàn)中的麻醉藥物[10]。
研究人員通常根據(jù)麻醉原理和麻醉過程中魚體的行為狀態(tài),將麻醉程度分為不同的階段。由于不同魚類在麻醉劑中的行為表現(xiàn)有差異,因此,研究人員對魚類麻醉程度的分期標(biāo)準(zhǔn)也不盡相同,但均將平衡感、呼吸頻率作為麻醉程度分期的重要指標(biāo)[11-13]。
在不受外界刺激的情況下,帶魚的游動行為異于其他魚類,大部分魚體直立水中,通過背鰭的波浪式擺動前行。隨著麻醉程度的深入,帶魚在直立狀態(tài)下難以保持平衡,當(dāng)進(jìn)入輕度麻醉期(3期)時(shí),魚體開始側(cè)游,并逐漸失去平衡感。進(jìn)入麻醉期后,魚體平衡感喪失,側(cè)臥于水底,只能通過呼吸頻率及鰓蓋張合是否連續(xù)來判斷魚體麻醉程度。此外,通過人為將魚體側(cè)置,魚體翻身的行為特征也可以作為判斷麻醉程度的標(biāo)準(zhǔn)。隨著麻醉程度的增加,被麻醉帶魚的翻身行為特征也出現(xiàn)顯著的階段性變化,分別為迅速翻身階段、勉強(qiáng)翻身階段、不能翻身階段、靜止和肌肉張力喪失階段。復(fù)蘇時(shí),將帶魚側(cè)置于自然海水中,在深度麻醉下,帶魚鰓蓋首先出現(xiàn)張合,呼吸開始恢復(fù)并連續(xù),頭部和尾部上翹身體成弓形來回蕩動,幅度逐漸增大后,實(shí)現(xiàn)翻身側(cè)游,最后帶魚能直立于水中。
呼吸頻率是衡量麻醉程度的重要指標(biāo)。大部分研究認(rèn)為,呼吸頻率隨麻醉程度的增加而降低,如用MS-222麻醉美洲鰣[4]、金魚Cyprinuscarpio[14],用丁香酚麻醉黃臘鲹Tmchinotusovatus[15]、黑鱸Micropterussalmoides[16]等。但也有研究發(fā)現(xiàn),在麻醉過程中,呼吸頻率先上升后下降,例如用MS-222 麻醉半滑舌鰨[6]、鱖魚Sinipercachuatsi[17]、圓斑星鰈Veraspervariegatus[18]等。本研究中發(fā)現(xiàn),帶魚在麻醉程度達(dá)到2期(深度鎮(zhèn)定期)前,呼吸頻率逐漸上升,之后呼吸頻率又下降,呈先升后降趨勢。因此,麻醉對呼吸頻率的影響與魚的種類及麻醉劑的種類和濃度有較大相關(guān)性。
麻醉劑的劑量對動物的麻醉程度與麻醉時(shí)間有顯著影響,相同條件下麻醉劑劑量越大,動物麻醉程度越深,入麻時(shí)間越短。彭寧東等[19]研究發(fā)現(xiàn):當(dāng) MS-222濃度為40 mg/L時(shí),赤眼鱒Spualiobarbuscurriculus幼魚的最終麻醉程度為2 期;當(dāng) MS-222 濃度為 120 mg/L時(shí),赤眼鱒幼魚的麻醉程度為6期。趙明等[18]研究發(fā)現(xiàn),MS-222濃度高于105 mg/L時(shí),圓斑星鰈最終麻醉程度均能達(dá)到6期。王秀華等[20]研究發(fā)現(xiàn),MS-222濃度從50 mg/L上升到200 mg/L時(shí),牙鲆的麻醉時(shí)間由288 s縮短至50 s。本研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng) MS-222濃度高于80 mg/L時(shí),東海帶魚幼魚的最終麻醉程度均能達(dá)到6期,且隨著麻醉劑濃度的增加,試驗(yàn)魚的入麻時(shí)間逐漸減少,這也與上述研究相一致。
Marking等[9]認(rèn)為,理想的麻醉濃度的標(biāo)準(zhǔn)為3 min之內(nèi)麻醉,5 min之內(nèi)蘇醒。按照此標(biāo)準(zhǔn),本研究中發(fā)現(xiàn),用MS-222麻醉東海帶魚幼魚的有效質(zhì)量濃度為120~140 mg/L。MS-222有效質(zhì)量濃度有種的特異性,游泳性魚類的有效MS-222質(zhì)量濃度一般低于底棲性魚類,如大麻哈魚、鯉等游泳性魚類的有效MS-222質(zhì)量濃度為80~100 mg/L,庸鰈、圓斑星鰈、半滑舌鰨等底棲性魚類的有效MS-222質(zhì)量濃度分別為250~480、150~230、120~210 mg/L[5,17]。本研究中,東海帶魚幼魚的有效MS-222質(zhì)量濃度低于上述底棲性魚類而高于上述游泳性魚類,這可能與東海帶魚的活動方式有關(guān),具體原因需進(jìn)一步研究。
皮質(zhì)醇是腎間組織分泌的一種激素,在魚體中具有廣泛的生理作用,被認(rèn)為是魚類應(yīng)激的一個靈敏信號[21-22]。目前,國內(nèi)外許多學(xué)者都將血液皮質(zhì)醇水平作為魚體應(yīng)激的一項(xiàng)重要指標(biāo),也有學(xué)者將血液皮質(zhì)醇水平用于魚類的麻醉研究中。如梁政遠(yuǎn)等[23]研究了用丁香油麻醉羅非魚Oreochromisspp.后其血液皮質(zhì)醇水平的變化;朱挺兵等[24]研究了電麻醉和MS-222麻醉后圓口銅魚Coreiusguichenoti血液皮質(zhì)醇的變化情況。本研究中也研究了不同濃度MS-222麻醉東海帶魚幼魚后不同時(shí)間段幼魚血液皮質(zhì)醇水平的變化,結(jié)果顯示,麻醉后6 h時(shí)各濃度組血清皮質(zhì)醇水平均低于0 h水平。這也與梁政遠(yuǎn)等[23]研究發(fā)現(xiàn)的用丁香油麻醉羅非魚后血液皮質(zhì)醇水平低于麻醉前的結(jié)論一致。這表明MS-222能降低帶魚幼魚血液皮質(zhì)醇水平。
血糖是魚類機(jī)能活動所需能量的來源,易受環(huán)境因子的影響而變化,通常運(yùn)動能力強(qiáng)的魚類血糖值高于運(yùn)動遲緩或底棲性魚類[25]。本研究中,東海帶魚幼魚經(jīng)MS-222麻醉后,血糖濃度呈逐漸降低的趨勢。這可能是麻醉脅迫下,魚體活動量降低,代謝減慢,所需能量減少,致使血糖合成降低,這與用MS-222麻醉史氏鱘的結(jié)果[26]較相似。
綜上所述,MS-222對東海帶魚幼魚具有良好的麻醉效果,其對東海帶魚幼魚的麻醉有效質(zhì)量濃度為 120~140 mg/L。配制的MS-222溶液可直接投入水體中對帶魚進(jìn)行麻醉,操作簡單方便,麻醉對象入麻快、復(fù)蘇快、安全邊界寬,是一種理想的麻醉劑。