葛 雷，吳彩鳳，戴建軍*，李 垚，呂玉華，陳 曉，張樹山，張德福

(1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室，上海 201106；4上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200025)

抑制素(INH)是一種由動(dòng)物性腺分泌的糖蛋白激素，能特異性作用于垂體，對(duì)基礎(chǔ)的卵泡刺激素(FSH)分泌和促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激的FSH分泌具有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系[1-2]。抑制素免疫是一種新型可增強(qiáng)動(dòng)物繁殖性能的方法，其通過抑制素抗體與體內(nèi)抑制素進(jìn)行中和反應(yīng)，從而降低抑制素對(duì)FSH分泌的抑制作用，進(jìn)而提高動(dòng)物體內(nèi)FSH激素水平、促進(jìn)排卵和提高胚胎質(zhì)量[3-4]。抑制素免疫在羊上的研究主要集中在對(duì)排卵及產(chǎn)仔數(shù)的影響[5]，其對(duì)超數(shù)排卵(簡(jiǎn)稱超排)影響的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用抑制素主動(dòng)免疫配合常規(guī)超排方法，研究其對(duì)崇明白山羊的超排效果和激素水平的影響，以期提高超排效果，增加排卵點(diǎn)數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和藥品

選擇健康且發(fā)情周期正常的崇明白山羊，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10頭。試驗(yàn)組免疫制劑為含重組抑制素蛋白的油乳劑(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院施振旦教授饋贈(zèng))。CIDR(陰道栓)購自新西蘭，卵泡刺激素(FSH)、氯前列烯醇(PGF2α)和促黃體生成素(LH)均為寧波市三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 抑制素免疫處理

試驗(yàn)組處理時(shí)，對(duì)選定的崇明白山羊臀部肌肉注射含重組抑制素蛋白的油乳劑，劑量為1 mL頭，抑制素蛋白質(zhì)量濃度為1 mgmL，免疫當(dāng)天記為INH 1d。INH 21d按相同劑量對(duì)崇明白山羊進(jìn)行二免處理。對(duì)照組注射不含重組抑制素蛋白的油乳劑，注射劑量、時(shí)間、頻次和部位與試驗(yàn)組相同。

1.3 超數(shù)排卵和同期發(fā)情處理

于INH 21d(即加強(qiáng)免疫當(dāng)天)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組羊埋植CIDR，INH 28d更換CIDR。INH 32d開始采用FSH三日遞減法進(jìn)行超數(shù)排卵處理，每天6：00和18：00各進(jìn)行一次FSH肌肉注射。INH 34d上午6：00注射FSH后再注射PGF2α，同時(shí)撤出CIDR。INH 35d肌肉注射LH抑制素免疫、超數(shù)排卵方法及激素用量見表1。根據(jù)發(fā)情情況，選擇合適發(fā)情時(shí)間與公羊自然交配。配種后48 h進(jìn)行輸卵管手術(shù)沖胚。

表1 抑制素免疫、超數(shù)排卵方法和激素用量

1.4 血清采集

于INH 31d、INH 39d頸靜脈采血，另外在超排期間每隔6 h頸靜脈采血一次。血液靜置6 h后4 000 rmin離心15 min，收集血清，-80℃保存待測(cè)。

1.5 手術(shù)沖胚和排卵點(diǎn)觀察

配種后48 h進(jìn)行手術(shù)沖胚和胚胎收集。手術(shù)前禁飼禁水12 h，全身麻醉后前低后高仰臥保定，乳房前腹中線開口，常規(guī)方法打開腹腔，暴露子宮、卵巢和輸卵管，記錄排卵點(diǎn)數(shù)目。采用TCM199+5% FBS(胎牛血清)分別于兩側(cè)輸卵管沖胚，靜置后于顯微鏡下收集胚胎，記錄每側(cè)輸卵管的胚胎數(shù)。

1.6 激素水平檢測(cè)

血清中FSH、LH、抗繆勒管激素(AMH)激素水平測(cè)定按照上海潤(rùn)裕生物科技有限公司所生產(chǎn)的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平測(cè)定按照Cayman Chemical Company(USA)生產(chǎn)的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0軟件對(duì)排卵點(diǎn)、沖胚數(shù)及激素水平進(jìn)行均數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示，P<0.05或P<0.01表明差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 排卵點(diǎn)和沖胚數(shù)

試驗(yàn)組的單側(cè)卵巢排卵點(diǎn)個(gè)數(shù)和單側(cè)輸卵管的沖胚數(shù)分別為11.69±1.40和9.88±1.64，均極顯著高于對(duì)照組的8.20±1.44和6.92±1.62。

2.2 抑制素免疫對(duì)超數(shù)排卵崇明白山羊血清FSH和LH分泌的影響

從圖1可以看出，抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊可以顯著提高其體內(nèi)FSH水平。在FSH注射之前的INH 31d，試驗(yàn)組血清中FSH濃度與對(duì)照組有顯著差異。在超排期間，試驗(yàn)組FSH水平顯著高于對(duì)照組。發(fā)情時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物FSH水平均大幅升高，且試驗(yàn)組亦極顯著高于對(duì)照組。INH 39d時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組血清中FSH水平開始下降，且兩者之間沒有顯著差異。

從圖2可以看出，抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊?qū)ζ銵H的分泌沒有顯著影響。發(fā)情時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組LH水平有大幅升高，但無顯著差異。INH 39d時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組血清中LH水平急劇下降，且兩者間無顯著差異。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；虛線部分表示未按每隔6 h進(jìn)行血樣采集和激素檢測(cè)，下同圖1 超排時(shí)血清FSH濃度的變化 Fig.1 Changes of serum FSH concentration in goats during superovulation

圖2 超排時(shí)血清LH濃度的變化 Fig.2 Changes of serum LH concentrations in goats during superovulating

2.3 抑制素免疫對(duì)超數(shù)排卵崇明白山羊血清AMH分泌的影響

從圖3可以看出，抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊?qū)ζ銩MH分泌有短時(shí)間的影響。INH 31d和INH 33d時(shí)，試驗(yàn)組AMH水平顯著高于對(duì)照組，其余時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組較對(duì)照組高，但并無顯著差異。

2.4 抑制素免疫對(duì)超數(shù)排卵崇明白山羊血清P4和E2水平的影響

從圖4可以看出，PGF2α注射后，試驗(yàn)組和對(duì)照組血清P4水平均急劇下降。INH 34d時(shí)，試驗(yàn)組的P4水平顯著低于對(duì)照組，其余時(shí)間無顯著差異。INH 39d時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組P4水平有緩慢上升趨勢(shì)，但兩者無顯著差異。

圖3 超排時(shí)血清AMH濃度的變化Fig.3 Changes of serum AMH concentrations in goats during superovulation

圖4 超排時(shí)血清P4濃度的變化 Fig.4 Changes of serum progesterone concentrations in goats during superovulation

從圖5可以看出，抑制素主動(dòng)免疫崇明白山羊?qū)ζ銭2的分泌沒有顯著影響。INH 36d時(shí)，E2水平迅速上升，兩組之間無顯著差異。INH 39d呈緩慢下降趨勢(shì)，兩組間亦無顯著差異。

圖5 超排時(shí)血清E2濃度的變化 Fig.5 Changes of serum oestradiol concentrations in goats during superovulation

3 討論與結(jié)論

抑制素是一種性腺分泌的糖蛋白激素，主要來源于睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞，其主要生理作用是與激活素共同調(diào)控FSH的合成和分泌[6]。抑制素還可以通過其他如自分泌或旁分泌途徑對(duì)性腺發(fā)揮局部影響作用，如優(yōu)勢(shì)卵泡可以通過旁分泌作用對(duì)周圍卵泡產(chǎn)生抑制效果，從而使非優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)生卵泡閉鎖[2]。

抑制素免疫是利用抑制素抗體免疫中和體內(nèi)內(nèi)源性抑制素，從而解除抑制素對(duì)FSH分泌的抑制作用，提高FSH水平，刺激未成熟卵泡發(fā)育。大量研究表明，抑制素免疫可以顯著提高動(dòng)物體內(nèi)FSH激素水平，增加大卵泡數(shù)量，提高排卵率，從而提高動(dòng)物繁殖能力[7-9]。而超數(shù)排卵技術(shù)可以誘導(dǎo)大量卵泡成熟排卵，增加可移植胚胎數(shù)，在家畜胚胎移植方面具有重要意義。抑制素免疫技術(shù)和超排技術(shù)均可以通過增加動(dòng)物卵泡數(shù)量和提高排卵率來提高動(dòng)物繁殖力，但兩者結(jié)合使用的研究較少，目前僅在提高牛超排效果中有抑制素免疫的相關(guān)報(bào)道。覃廣勝等[3]在水牛和桑潤(rùn)滋等[10]在荷斯坦母牛與西雜青年母牛上的研究發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫結(jié)合超排可以提高牛的胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)抑制素免疫能有效地抑制崇明白山羊體內(nèi)內(nèi)源性抑制素的活性，并持續(xù)、顯著提高崇明白山羊超排期間的FSH激素水平，刺激未成熟卵泡發(fā)育，從而極顯著增加排卵點(diǎn)個(gè)數(shù)和沖胚數(shù)，提高超排效果。

AMH作為一種可以評(píng)價(jià)人類卵巢狀態(tài)的標(biāo)記物，其水平可以預(yù)測(cè)卵巢狀態(tài)和超排效果[11-13]。畢江華等[14]發(fā)現(xiàn)牛AMH濃度越高，超排效果越好，故AMH可作為臨床預(yù)測(cè)動(dòng)物卵巢狀態(tài)、評(píng)價(jià)超排效果的指標(biāo)之一。在抑制素免疫相關(guān)研究中，并未見關(guān)于AMH激素水平的研究。本試驗(yàn)通過檢測(cè)AMH水平發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫結(jié)合常規(guī)超排技術(shù)可以顯著提高崇明白山羊體內(nèi)AMH水平，此結(jié)果與排卵點(diǎn)數(shù)量增加相符，且能反映抑制素免疫可以增強(qiáng)超排效果。

抑制素免疫對(duì)其他激素如LH、P4、E2的影響仍存在爭(zhēng)議。部分研究者認(rèn)為抑制素免疫可以提高或降低動(dòng)物體內(nèi)LH激素水平[4,15]，但也有研究表明抑制素免疫并不會(huì)影響LH激素水平，僅會(huì)誘導(dǎo)提前出現(xiàn)LH峰，即免疫動(dòng)物會(huì)提前排卵，但提前幅度較小[9,16-17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制素免疫并不會(huì)影響崇明白山羊體內(nèi)LH激素水平，且并未出現(xiàn)LH提前升高的現(xiàn)象，這與桑潤(rùn)滋等在牛超排上的研究結(jié)果相一致[10]。由于LH對(duì)抑制素的敏感程度較FSH低，且合成相對(duì)較慢，同時(shí)超排時(shí)LH上升期較長(zhǎng)，故不能觀察到免疫動(dòng)物L(fēng)H提前升高。大部分研究發(fā)現(xiàn)抑制素免疫對(duì)動(dòng)物發(fā)情期的P4水平?jīng)]有影響，其主要影響體現(xiàn)在黃體期(即排卵后7d左右)免疫組P4水平會(huì)顯著高于非免疫組[9,17-18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組血清中P4水平均在PGF2α注射后迅速下降，且兩組激素水平整體上無顯著差異，僅在PGF2α注射時(shí)間點(diǎn)上試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組，分析原因可能是由于超排時(shí)大量激素注射導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)。故抑制素免疫對(duì)超排期間動(dòng)物體內(nèi)P4水平并無顯著影響。E2水平能反映動(dòng)物卵巢功能情況，較高的E2水平反映動(dòng)物良好的受孕能力。抑制素免疫對(duì)E2激素水平的影響對(duì)不同動(dòng)物而言存在差異，奶牛、山羊等動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn)其可以提高E2水平[18-20]，但對(duì)小鼠并沒有顯著影響[21]。FSH水平會(huì)影響E2水平的變化，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著FSH激素水平的上升，E2水平也顯著升高，并未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組和對(duì)照組之間E2水平有顯著差異。桑潤(rùn)滋等[10]在類似試驗(yàn)中也并沒有發(fā)現(xiàn)抑制素免疫結(jié)合超排能對(duì)牛體內(nèi)E2水平產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在崇明白山羊的超數(shù)排卵過程中使用抑制素免疫能顯著提高崇明白山羊FSH和AMH的激素水平，增加排卵點(diǎn)數(shù)目和手術(shù)后的沖胚數(shù)，達(dá)到有效提高超排的效果。