馬興聰，閆婉君，趙小瑤，趙茜茜，趙梓彤，陳銀溪，楊 倩，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院，陜西西安 710004)

腫瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答是眾多免疫分子及細(xì)胞群參與的多步驟反應(yīng)過(guò)程，密切影響腫瘤的進(jìn)展方向。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)是指被募集至腫瘤間質(zhì)或瘤內(nèi)的淋巴細(xì)胞群，其浸潤(rùn)水平及功能對(duì)抗腫瘤免疫效果產(chǎn)生重要影響[1]。大量回顧性臨床研究顯示，TILs的類(lèi)型及數(shù)量與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)[2]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)和HER2過(guò)表達(dá)型乳腺癌中，淋巴細(xì)胞瘤內(nèi)浸潤(rùn)顯著增多，并提示較好的生存及疾病結(jié)局[3-4]。此外，有報(bào)道指出TILs水平影響TNBC及HER2過(guò)表達(dá)型乳腺癌對(duì)新輔助化療、輔助化療及曲妥珠單抗治療的反應(yīng)性[5-7]。因此，研究乳腺癌中影響淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)因素并進(jìn)行干預(yù)，可能有助于提高患者的抗腫瘤免疫機(jī)能，提高臨床腫瘤治療效果，改善患者預(yù)后。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是造血系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)外周淋巴細(xì)胞的成熟、分化及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如，Wnt/β-catenin信號(hào)可負(fù)性調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞功能活化[8]。遺傳變異或腫瘤誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DCs)內(nèi)β-catenin信號(hào)可調(diào)控免疫應(yīng)答與免疫耐受之間的平衡[9]。結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤均可檢測(cè)到Wnt/β-catenin信號(hào)異常激活[10]。惡性黑色素瘤中，SPRANGER等[11]首次報(bào)道腫瘤內(nèi)源性Wnt/β-catenin信號(hào)活化抑制淋巴細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境浸潤(rùn)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)抗PD-L1/抗-CTLA-4單克隆抗體治療產(chǎn)生抵抗。上述研究結(jié)果提示，Wnt/β-catenin信號(hào)可能在腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而其是否參與調(diào)控乳腺癌抗腫瘤免疫反應(yīng)尚不清楚。

本研究通過(guò)檢測(cè)乳腺癌β-catenin的表達(dá)及間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的分布情況，分析兩者之間的相關(guān)性，探究Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)乳腺癌免微環(huán)境的影響，為乳腺癌的抗腫瘤治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院2013年6月至2014年12月原發(fā)性乳腺癌女性患者90例手術(shù)組織蠟塊，均經(jīng)術(shù)后病理確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，術(shù)前未行放化療。患者年齡29～75歲，中位年齡50歲。相關(guān)臨床病理資料采集自本院病理診斷報(bào)告。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為≥1%腫瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度著色。HER2陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為IHC評(píng)分3+或IHC評(píng)分2+，熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)結(jié)果陽(yáng)性[12]。

1.2HE染色檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞乳腺癌組織標(biāo)本制作5 μm厚度連續(xù)石蠟切片。切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水處理后，以蘇木素-伊紅染料染色。染色完成后進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后以中性樹(shù)脂封片。目前多數(shù)的研究表明間質(zhì)TILs較腫瘤內(nèi)TILs更有預(yù)測(cè)價(jià)值，可重復(fù)性強(qiáng)。故本研究關(guān)注腫瘤間質(zhì)TILs。腫瘤間質(zhì)TILs為癌巢間質(zhì)組織中散在分布的，與腫瘤細(xì)胞沒(méi)有直接接觸的淋巴細(xì)胞。依SALGADO等[13]制定的乳腺癌TILs評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及指南，間質(zhì)TILs百分比定義為顯微鏡視野下，腫瘤邊界內(nèi)單核淋巴細(xì)胞所分布的區(qū)域占據(jù)間質(zhì)總面積的百分比。視野選擇避免有人為擠壓、壞死、退行玻璃樣變和之前針芯活檢部位的TILs。在異質(zhì)性腫瘤內(nèi)，評(píng)估不同區(qū)域的TILs，報(bào)告均值。避免將目光聚焦在TILs明顯增多的熱點(diǎn)區(qū)域。所有結(jié)果均由有經(jīng)驗(yàn)的2位病理科醫(yī)師在不了解患者臨床資料的情況下獨(dú)立判斷。以半定量法報(bào)告結(jié)果，將腫瘤間質(zhì)TILs百分比分為T(mén)ILs低、TILs中、TILs高3級(jí)，分別對(duì)應(yīng)間質(zhì)TILs百分比>10%、10%～40%及≥40%。

1.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)β-catenin表達(dá)采用免疫組化SP法檢測(cè)乳腺癌組織β-catenin表達(dá)。5 μm石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水處理后，置于枸櫞酸鈉緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)中進(jìn)行熱抗原修復(fù)15 min，待冷卻至室溫。接著采用免疫組化試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)完成后續(xù)步驟。切片上滴加0.88 mol/L H2O2溶液室溫孵育10 min，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗。滴加正常羊血清封閉，室溫20 min。將羊血清傾去，每張切片滴加60 μL一抗(兔抗人β-catenin單克隆抗體，ab32572, clone E247, Abcam, 美國(guó)；1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。取出切片后1×PBS漂洗，滴加HRP兔型二抗，37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。1×PBS漂洗后進(jìn)行DAB顯色，接著采用蘇木素復(fù)染。常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。釆用1×PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。整張切片由自動(dòng)玻片掃描儀(Zeiss Axio Scan .Z1, Jena, 德國(guó))拍照。

1.4組化結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)β-catenin表達(dá)水平的評(píng)價(jià)分為陽(yáng)性細(xì)胞比例及細(xì)胞胞質(zhì)/胞核染色強(qiáng)度兩方面，采用半定量積分法判定結(jié)果。每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野觀察，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。綜合組織學(xué)評(píng)分由兩類(lèi)評(píng)分相乘，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將(-)及(+)判定為β-catenin陰性；()及()判定為β-catenin陽(yáng)性。評(píng)分均由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法判定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各分類(lèi)資料組間比較采用卡方(χ2)檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。等級(jí)資料比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。兩指標(biāo)之間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件完成，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌β-catenin表達(dá)水平與臨床病理特征及腫瘤分子分型的關(guān)系90例乳腺癌樣本的臨床病理信息及腫瘤組織β-catenin表達(dá)情況如表1所示。乳腺癌組織β-catenin胞質(zhì)/胞核異常聚集與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER2表達(dá)及腫瘤臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性，而與腫瘤組織學(xué)分級(jí)以及ER、PR表達(dá)狀態(tài)相關(guān)。乳腺癌β-catenin陽(yáng)性率隨組織學(xué)分級(jí)的增高而有增加趨勢(shì)。高分化(G1)組β-catenin陽(yáng)性率為41.9%，中分化(G2)組為65.6%，高分化組(G3)為77.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ER陰性組β-catenin陽(yáng)性率顯著高于ER陽(yáng)性組(78.0%vs. 46.9%，P<0.01)。PR陰性組β-catenin陽(yáng)性率也較陽(yáng)性組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(76.0%vs. 49.0%，P<0.01)。

2.2β-catenin在不同乳腺癌分子亞型中的表達(dá)情況由于乳腺癌分子亞型分類(lèi)主要依據(jù)病理切片ER、PR及HER2表達(dá)情況，而上述結(jié)果提示β-catenin的表達(dá)與乳腺癌患者ER、PR表達(dá)狀況密切相關(guān)，因此，我們進(jìn)一步將病例分為luminal A型(36.7%)，luminal B型(24.4%)，HER2過(guò)表達(dá)型(20.0%)及TNBC(18.9%)，分析β-catenin在不同乳腺癌分子亞型中的表達(dá)情況。如表2所示， β-catenin在激素受體陰性乳腺癌(HER2過(guò)表達(dá)型及TNBC)的表達(dá)高于激素受體陽(yáng)性組(luminal A型與luminal B型)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路的功能在激素受體陰性乳腺癌HER2過(guò)表達(dá)型及TNBC中顯著異?；罨?/p>

表1β-catenin表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Correlation between the expression of β-catenin and clinicopathologic parameters in 90 primary breast cancer patients

[n(%)]

表2不同乳腺癌分子亞型中β-catenin的表達(dá)

Tab.2 β-catenin expression among molecular subtypes of breast cancer

[n(%)]

* 激素陽(yáng)性型乳腺癌(Luminal A型與Luminal B型)與激素陰性型(HER2過(guò)表達(dá)型與三陰性型)乳腺癌比較。

2.3乳腺癌β-catenin異常表達(dá)與腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的相關(guān)性對(duì)連續(xù)切片分別進(jìn)行β-catenin及間質(zhì)TILs的染色，并選取相同視野對(duì)兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià)，以觀察Wnt/β-catenin信號(hào)與乳腺癌TILs的相關(guān)性。如圖1所示，腫瘤間質(zhì)TILs密度較高的乳腺癌組織，其對(duì)應(yīng)β-catenin表達(dá)顯著高于TILs較少的腫瘤組織。β-catenin評(píng)分隨著腫瘤間質(zhì)TILs密度的升高而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2A)。進(jìn)一步通過(guò)Pearson相關(guān)分析得到間質(zhì)TILs百分比與β-catenin胞質(zhì)/胞核陽(yáng)性細(xì)胞百分比之間具有線性相關(guān)關(guān)系(r=0.732，P<0.001，圖2B)。在激素陰性乳腺癌亞型中，間質(zhì)TILs中、高密度的乳腺癌分別有92.9%與88.9%的患者β-catenin異常表達(dá)，而間質(zhì)TILs低密度的乳腺癌對(duì)應(yīng)僅有41.7%為β-catenin異常表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。在激素受體陽(yáng)性組，我們也觀察到近似趨勢(shì)(P<0.01，表4)。

圖1乳腺癌組織間質(zhì)TILs密度及對(duì)應(yīng)β-catenin的表達(dá)情況

Fig.1 Correlation between TILs and β-catenin in breast cancer

A～C：HE染色(×400)；A：60%腫瘤間質(zhì)TILs浸潤(rùn)；B：20%腫瘤間質(zhì)TILs浸潤(rùn)；C：5%腫瘤間質(zhì)TILs浸潤(rùn)；D～F：A～C對(duì)應(yīng)連續(xù)切片中β-catenin免疫組化染色(×400)，組織學(xué)評(píng)分分別為4分、3分、2分。

圖2β-catenin異常表達(dá)與腫瘤間質(zhì)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的相關(guān)性

Fig.2 Correlation of β-catenin expression with stromal TILs in 90 breast cancer patients

A：Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)分析腫瘤間質(zhì)TILs浸潤(rùn)密度與β-catenin評(píng)分的相關(guān)性；B：Pearson相關(guān)分析揭示腫瘤間質(zhì)TILs浸潤(rùn)密度與β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞百分比的線性相關(guān)關(guān)系。

表3激素受體陰性乳腺癌β-catenin表達(dá)與間質(zhì)TILs分布

Tab.3 Correlation between presence of stromal TILs and β-catenin expression in hormone receptor negative breast cancer

[n(%)]

表4激素受體陽(yáng)性乳腺癌β-catenin表達(dá)與間質(zhì)TILs分布

Tab.4 Correlation between presence of stromal TILs and β-catenin expression in hormone receptor positive breast cancer

[n(%)]

3 討 論

Wnt信號(hào)通路具有高度進(jìn)化保守性，其作用涉及多種基本的細(xì)胞生物學(xué)功能，如胚胎發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞存活或死亡的選擇，細(xì)胞極性的決定，細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移，干細(xì)胞自我更新等，在組織器官發(fā)育及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該通路功能異常能夠?qū)е聜€(gè)體發(fā)育缺陷和疾病。經(jīng)典Wnt/β-catenin通路信號(hào)異常是人惡性腫瘤中最常見(jiàn)的信號(hào)異常之一[14]。免疫學(xué)相關(guān)研究表明，Wnt/β-catenin通路是調(diào)控胸腺細(xì)胞發(fā)育及外周淋巴細(xì)胞功能的關(guān)鍵信號(hào)，可通過(guò)多種途徑參與腫瘤免疫的調(diào)節(jié)[8]。目前Wnt/β-catenin信號(hào)活化對(duì)抗腫瘤免疫的影響尚存在爭(zhēng)議。一方面，腫瘤內(nèi)源性Wnt/β-catenin信號(hào)激活后，可抑制DCs抗原提呈和促炎性細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子分泌，并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化[15-18]，從而抑制腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的免疫監(jiān)視及清除功能。另一方面，Wnt/β-catenin是維持造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)自我更新及干性的關(guān)鍵信號(hào)[19]。在小鼠模型中，激活Wnt信號(hào)通路可抑制CD8+T細(xì)胞向效應(yīng)細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)出具有與記憶性干細(xì)胞樣T細(xì)胞(stem cell memory T cells, TSCM)相似表型的CD8+T細(xì)胞亞群，而這種細(xì)胞與中央記憶性T細(xì)胞(central memory T cells, TCM)或效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells, TEM)相比，具有更強(qiáng)的增殖及抗腫瘤功能[20]。這些研究結(jié)果提示W(wǎng)nt/β-catenin通路或能促進(jìn)成熟CD8+T細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性，對(duì)提升T細(xì)胞免疫治療效果有潛在應(yīng)用價(jià)值。

盡管乳腺癌并非傳統(tǒng)意義上的免疫原性惡性腫瘤，但近年來(lái)大量臨床研究揭示免疫系統(tǒng)在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。TILs與原發(fā)性乳腺癌預(yù)后具有相關(guān)性。在HER2過(guò)表達(dá)型及TNBC中，高水平TILs與患者更好的治療反應(yīng)及疾病結(jié)局相關(guān)[3-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin胞質(zhì)/胞核過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者ER/PR狀態(tài)相關(guān)。進(jìn)一步亞型分析揭示激素受體陰性乳腺癌(HER2過(guò)表達(dá)型及TNBC)中β-catenin過(guò)表達(dá)顯著高于激素受體陽(yáng)性乳腺癌，與文獻(xiàn)報(bào)道的TILs分布趨勢(shì)相近。

Wnt/β-catenin通路與TILs分布相關(guān)性的臨床研究鮮有報(bào)道。在惡性黑色素瘤研究中，SPRANGER等[11]報(bào)道腫瘤內(nèi)源性Wnt/β-catenin信號(hào)活化抑制淋巴細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境浸潤(rùn)，導(dǎo)致荷瘤小鼠對(duì)PD-L1/抗-CTLA-4單克隆抗體治療產(chǎn)生抵抗。本研究結(jié)果提示，乳腺癌間質(zhì)TILs密度與Wnt/β-catenin信號(hào)異常表達(dá)在激素受體陽(yáng)性及陰性乳腺癌中均呈正相關(guān)。這一結(jié)果的不一致性可能與不同的腫瘤背景及檢測(cè)指標(biāo)、方法的差異相關(guān)。由于HE染色僅能獲得形態(tài)學(xué)及數(shù)量信息，在研究浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)方面受到限制，進(jìn)一步探究Wnt/β-catenin通路活性與乳腺癌TILs功能特征的相關(guān)性及Wnt/β-catenin信號(hào)干預(yù)腫瘤免疫的分子機(jī)制，對(duì)揭示腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的影響因素，尋求提高腫瘤免疫治療效果的干預(yù)途徑具有潛在臨床價(jià)值。