龔鳴敬，李雪聯(lián)，古明鮮，萬(wàn)書林，管天冰，何平，王建，戴傳云，*

（1.重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401331；2.重慶寰瑞生物技術(shù)有限公司，重慶401332；3.重慶璧山國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)，重慶402760）

神經(jīng)節(jié)苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘氨醇脂，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的腦組織細(xì)胞膜中，由于其具有促進(jìn)腦神經(jīng)元的成熟和受損神經(jīng)的再生作用，因此對(duì)老年癡呆、心腦血管損傷及帕金森等神經(jīng)性疾病的治療具有較好的臨床效應(yīng)[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于神經(jīng)節(jié)苷脂的分離與純化研究，提出了諸多方法如：丙酮提取法[3]、氯仿-甲醇抽提法[4]、四氫呋喃提取法[5]和索氏提取法[6]等，然而上述提取方法得到的產(chǎn)物仍含有較多雜質(zhì)，主要包括磷脂、膽固醇、硫酸脂等[7]，如何獲取高純度的神經(jīng)節(jié)苷脂，對(duì)其科學(xué)研究發(fā)展與應(yīng)用具有重大意義。

硅膠柱層析作為經(jīng)典的分離純化技術(shù)，具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn)，已被廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域[8-10]。本研究在傳統(tǒng)索氏提取工藝基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用紫外-可見分光光度法定量分析，探討神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物在硅膠柱層析的最佳純化工藝，以提高產(chǎn)物中神經(jīng)節(jié)苷脂的純度，進(jìn)而為其二次開發(fā)與利用提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬腦：市售；異戊醇、硫酸銅、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、間苯二酚、鹽酸（分析純）、硅膠（200目～300目）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品、神經(jīng)節(jié)苷酯標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma；試驗(yàn)用水為二次純化水。

間苯二酚-鹽酸工作液：量取2%間苯二酚溶液10mL至100mL容量瓶中，加入含有0.25 mL、0.1 mol/L硫酸銅溶液的濃鹽酸80 mL，加水定容搖勻。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州華特儀器設(shè)備有限公司；BCD-221EMK3A型冰箱：海爾電器；202A-4型電熱恒溫干燥箱：蘇州市江東精密儀器有限公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機(jī)：寧波雙嘉儀器有限公司；耐腐蝕層析柱（25 mm×500 mm）：泰州市蘇瑞玻璃儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 粗提物制備

取新鮮豬腦1 kg，勻漿攪拌后加入3 L氯仿-甲醇（體積比為1∶2），密封容器，攪拌過(guò)夜，次日離心（2 000 r/min、10 min），收集上清液。離心后的不溶物繼續(xù)加入氯仿-甲醇（體積比為1∶2），攪拌過(guò)夜后，次日離心（2 000 r/min、10 min），合并上清液，冷凍干燥，即為神經(jīng)節(jié)苷酯的粗提物[4]。

1.3.2 硅膠柱層析

稱取定量的硅膠浸于洗脫劑內(nèi)溶脹30 min，濕法裝柱，洗脫液平衡15 min后上樣，上樣速度2.5 BV/h，吸附平衡后，洗脫劑以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得產(chǎn)物，通過(guò)下式計(jì)算得到產(chǎn)物的神經(jīng)節(jié)苷酯回收率。

式中：m0為粗提物上樣量，g；w0為粗提物中神經(jīng)節(jié)苷酯含量，%；md為產(chǎn)物質(zhì)量，g；wd為產(chǎn)品中神經(jīng)節(jié)苷酯含量，%；R為回收率，%。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 硅膠用量影響

分別配制濃度6%的樣品溶液，取相同體積加入至裝有 30、35、40、45、50 g 硅膠的層析柱中，經(jīng)乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑洗脫后，分別收集柱后洗脫液，測(cè)定各自神經(jīng)節(jié)苷酯含量，計(jì)算其回收率。

1.3.3.2 上樣濃度影響

分別配制濃度2%、4%、6%、8%、10%的樣品溶液，取相同體積加入裝有35 g硅膠的層析柱中，經(jīng)乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑洗脫后，分別收集柱后洗脫液，測(cè)定各自神經(jīng)節(jié)苷酯含量，計(jì)算其回收率。

1.3.3.3 洗脫劑影響

洗脫劑對(duì)粗提物的洗脫效果，決定其柱后洗脫液中待測(cè)組分的回收率，因此采用薄層色譜法選擇對(duì)粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂具有良好分離效果的洗脫劑。吸取相同體積的樣品溶液點(diǎn)樣至硅膠板后，揮干溶劑，分別放入不同配比洗脫劑的燒杯內(nèi)，待洗脫劑展開至板端1 cm處取出，揮干溶劑，顯色，以標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，計(jì)算目標(biāo)化合物在不同配比的洗脫劑中比移值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[11-12]，以硅膠用量（A）、上樣濃度（B）、洗脫劑配比（C）為響應(yīng)因素，回收率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）分析試驗(yàn)，確定豬腦組織中神經(jīng)節(jié)苷酯粗提物的最佳純化工藝。

1.3.5 定量分析方法

神經(jīng)節(jié)苷脂中含唾液酸的寡糖鏈易與間二苯酚-鹽酸溶液反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物，在可見光區(qū)具有最大吸收[13]，因此采用移液槍精密移取100 μg/mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 5 mL 具塞試管中，隨后加入間二苯酚-鹽酸溶液2 mL，振搖后置于100℃沸水加熱15 min，隨后冷卻加入4 mL異戊醇，離心取上層有機(jī)相，于620 nm最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各自吸光度，繪制唾液酸濃度（X）-吸光度（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：y=1.765 x-0.262（r=0.992 1），表明唾液酸濃度在10 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，吸光度與其線性關(guān)系良好。

按校準(zhǔn)曲線測(cè)定步驟，測(cè)定樣品的吸光度A，根據(jù)校準(zhǔn)曲線和吸光度計(jì)算唾液酸含量，進(jìn)而計(jì)算樣品溶液中神經(jīng)節(jié)苷酯含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗提物含量

異戊醇作空白對(duì)照，精密稱取神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物0.5 g，按照1.3.5所述測(cè)定方法于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，代入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量，結(jié)果見表1所示。

表1 粗取物中神經(jīng)節(jié)苷脂含量Table 1 The content of gangliosides of crude extract

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 硅膠用量分析

層析柱內(nèi)裝載不同質(zhì)量的硅膠對(duì)粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂的回收率影響，見圖1所示。

從圖1可見，隨著硅膠用量增多，產(chǎn)物中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量不斷增大，但繼續(xù)增大硅膠用量，回收率則逐漸下降，這歸因于神經(jīng)節(jié)苷脂在硅膠中殘留量逐漸增大，因此選擇30、35、40 g作為硅膠用量的響應(yīng)因素水平。

圖1 硅膠用量影響Fig.1 The effect of slica amount

2.2.2 上樣濃度分析

上樣濃度對(duì)粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂的回收率影響，見圖2所示。

圖2 上樣濃度的影響Fig.2 The effect of gangliosides concentration in crude extract

從圖2可見，隨著上樣濃度增大，產(chǎn)物中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量不斷下降，而回收率卻不斷增加。這歸因于固定的硅膠用量下，增加上樣濃度，目標(biāo)化合物在硅膠的殘留比逐漸降低，從而回收率提高，但由于其和部分雜質(zhì)洗脫時(shí)間重疊，使得產(chǎn)物的含量逐漸下降，因此選擇4%、6%、8%作為上樣濃度的響應(yīng)因素水平。

2.2.3 洗脫劑配比分析

表2為不同配比的洗脫劑洗脫目標(biāo)化合物的比移值。

表2 不同體積的乙酸乙酯與甲醇在薄層色譜層析（thin-layer chromatography，TLC）中比移值（Rf）Table 2 The Rfvalue of ethyl acetate and methyl alcohol in different volume on TLC

從表2中可見，當(dāng)洗脫劑為乙酸乙酯與甲醇（V∶V=4∶1），分離效果最佳，因此選擇乙酸乙酯與甲醇體積比3∶1、4∶1、5∶1作為洗脫劑配比的響應(yīng)因素水平。

2.3 響應(yīng)面法分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，各響應(yīng)因素水平見表3所示。表4為試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與響應(yīng)結(jié)果。

表3 響應(yīng)面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

對(duì)表4結(jié)果多元回歸擬合，得到以回收率為目標(biāo)的函數(shù)，關(guān)于各參數(shù)編碼值的二次回歸方程為：R=83.8-0.57A+2.24B+0.54C+0.007AB+0.45AC-0.075BC-2.81A2-1.24B2+0.36C2，對(duì)各參數(shù)進(jìn)行方差分析，見表5所示。

從表5可知，該回歸模型P＜0.01，表明其對(duì)粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂的回收具有較好預(yù)測(cè)性，同時(shí)R2=0.943 7與R2Adj=0.871 4都接近于1，表示該模型可靠性較高，而變異系數(shù)＜1%，可知其它因素對(duì)響應(yīng)值的影響較小，因此該回歸方程可替代實(shí)際值對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。一次項(xiàng)B對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂的回收率影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而交互項(xiàng)影響均不顯著。從F值可知，影響神經(jīng)節(jié)苷脂的回收率強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷蠘訚舛龋竟枘z用量＞洗脫劑配比。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

2.4 響應(yīng)面模型分析

圖3反映不同兩因素交互作用的響應(yīng)面，其中曲面越大代表二者交互作用越大[14]，在中心點(diǎn)附近回收率愈高[15]。通過(guò)解二次多項(xiàng)回歸擬合方程得到最優(yōu)條件為：將質(zhì)量濃度7.75%的粗提物樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑以2.0 BV/h流速洗脫，預(yù)測(cè)產(chǎn)物中神經(jīng)節(jié)苷脂的最大回收率為86.7%。

圖3 不同兩因素交互作用響應(yīng)面Fig.3 Response surface of different two factors interaction

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得最佳純化工藝的可實(shí)施性，將質(zhì)量濃度為7.75%的樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，定量分析神經(jīng)節(jié)苷脂的含量，結(jié)果見表6所示。

表6 純化后產(chǎn)物的神經(jīng)節(jié)苷脂含量Table 6 The content of gangliosides in product after purification

通過(guò)表6所得純化后產(chǎn)物的神經(jīng)節(jié)苷脂含量，計(jì)算得出神經(jīng)節(jié)苷脂的回收率為86.9%，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，對(duì)相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)作用。提取物中神經(jīng)節(jié)苷脂含量由純化前12.23%提高至純化后35.32%，為純化前的2.89倍。

3 結(jié)論

本研究采用硅膠柱層析法純化豬腦組織粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂，利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳純化工藝條件：將質(zhì)量濃度為7.75%的樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑以2.0 BV/h流速洗脫，洗脫產(chǎn)物中神經(jīng)節(jié)苷脂回收率為86.9%，目標(biāo)化合物含量為純化前的2.89倍。該工藝操作簡(jiǎn)便、純化效率較高，適合推廣于相關(guān)工業(yè)應(yīng)用。