申曉慧，馮 鵬，李如來(lái)，姜 成，李增杰，李志民，王 強(qiáng)

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007；2佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，哈爾濱150001）

0 引言

引起作物誘變變異的外界因素主要有兩個(gè)方面，一是物理因素，二是化學(xué)因素。作物誘發(fā)變異與自然變異相比較，具有如下特點(diǎn)：誘發(fā)變異能夠增加突變頻率、擴(kuò)展變異類型、加大基因重組幾率、拓寬突變譜等特征，縮短篩選出具有利用價(jià)值的突變單株，減少育種年限[1-4]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)植物誘變技術(shù)已經(jīng)很成熟，技術(shù)方法多樣化，在物理誘變、化學(xué)誘變乃至航天誘變研究方面均取得了良好效果，并在誘變機(jī)理分析方面進(jìn)行了詳細(xì)研究，同時(shí)針對(duì)植物特異性目標(biāo)進(jìn)行不斷改良、優(yōu)化，極大地提高了作物誘變效率。然而不同誘變處理方式影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同方面，生理生化研究是誘變育種選擇的重要輔助手段之一。任衛(wèi)波等[5]利用實(shí)踐八號(hào)搭載苜蓿種子研究表明，苜蓿誘變后糖類與脂類含量較誘變前下降。尹淑霞等[6]采用60Co-γ射線輻照黑麥草種子，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑麥草經(jīng)60Co-γ射線輻照后，其過(guò)氧化物同工酶發(fā)生變化，后代材料中POD同工酶酶譜特征也因輻照劑量不同而變化。韓微波等[7]利用衛(wèi)星搭載苜蓿種子研究其生理特性，結(jié)果表明，搭載后不同苜蓿品種苜蓿過(guò)氧化氫酶(POD)活性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，可溶性蛋白含量有升高，但超氧物歧化酶(SOD)活性則下降。李秀貞等[8]采用不同射線輻射如60Co-γ射線、激光、快中子輻射小麥種子，結(jié)果表明小麥可溶性蛋白質(zhì)含量明顯增加，增加幅度最大的比對(duì)照材料高出9.09%。

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)作為多年生豆科牧草在世界范圍內(nèi)被廣泛種植。紫花苜蓿是中國(guó)牧草栽培面積最大，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益最好的豆科牧草[9-11]。目前，隨著中國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整和草地生態(tài)建設(shè)逐步壯大，苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展空間上升，種植面積尤其是紫花苜蓿種植數(shù)量呈逐年增加趨勢(shì)[12]。作為產(chǎn)糧和畜牧業(yè)大省的黑龍江省，地理位置特殊，具有緯度高、氣候寒冷的特性，但是其獨(dú)特的氣候條件特點(diǎn)，使一些高產(chǎn)高效紫花苜蓿品種的生產(chǎn)收到了極大限制。本試驗(yàn)通過(guò)開展植物誘變技術(shù)對(duì)當(dāng)?shù)刂髟云贩N進(jìn)行不同誘變處理，通過(guò)分析其對(duì)生理生化指標(biāo)的影響，以期篩選出適宜的誘變處理方法，為提高中國(guó)北方苜?？剐匝芯考败俎ＵT變育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試材

供試苜蓿品種為‘ 公農(nóng) 1號(hào) ’、‘Wega7F’、‘WL319HQ’、‘敖漢苜?！?，‘WL319HQ’苜蓿種子由北京正道生態(tài)科技有限公司提供，‘Wega7F’、‘公農(nóng)1號(hào)’、‘敖漢苜?！N子，由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年12月對(duì)4種紫花苜蓿干種子進(jìn)行誘變處理，方法如下：

60Co-γ射線：4個(gè)苜蓿品種種子進(jìn)行60Co-γ射線輻照處理，設(shè)計(jì)劑量為150、300、450 Gy，以0劑量為對(duì)照處理，3次重復(fù)，處理時(shí)間為7天。

紫外線：選取篩選過(guò)苜蓿干種子將其包于紗布中，用45℃的蒸餾水浸泡1 h，之后0.1%的氯化汞溶液將處理好的種子進(jìn)行消毒8～10 min。最后用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)清洗3～5次，紫外燈瓦數(shù)為40 W，照射距離為距離種子同水平位置40 cm處，照射時(shí)間分別為30、60、90 min。3次試驗(yàn)重復(fù)。

甲基磺酸乙酯(EMS)：選取篩選過(guò)苜蓿干種子，用濃硫酸浸泡4～5 min后蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次。再用事先配置好的4℃磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)浸泡15 h使種子完全吸水膨脹。最后將種子浸泡在EMS濃度為0.1%、0.2%、0.4%(v/v)的溶液（磷酸緩沖液配制）再放置在室溫黑暗條件15 h，期間對(duì)種子進(jìn)行搖動(dòng)使其充分吸收藥液，之后蒸餾水反復(fù)沖洗，去除殘留種子表面的EMS溶液。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

不同誘變處理后種子盆栽，幼苗長(zhǎng)至成苗時(shí)移栽至佳木斯分院苜蓿試驗(yàn)田，苜蓿移栽株距30 cm，行距45 cm。期間正常苜蓿大田管理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

于紫花苜蓿盛花期（7月末）隨機(jī)采取10株新鮮功能葉片混勻用于各生理指標(biāo)測(cè)定。氮藍(lán)四唑法[13]測(cè)定SOD活性，愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定POD活性，紫外分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[14]。硫代巴比妥酸法[15]測(cè)定MDA濃度?？捡R斯亮藍(lán)法[15]測(cè)定可溶性蛋白含量。蒽酮比色法[15]測(cè)定可溶性糖含量，磺基水楊酸法[15]測(cè)定脯氨酸含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所采集試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理用Microsoft Excel 2007和SAS8.0(SASInstituteInc.,2006)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿SOD活性的影響

由表1可以看出，不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿葉片SOD活性影響不同。其中60Co-γ輻射處理促進(jìn)了苜蓿SOD的積累，且均高于對(duì)照，150 Gy劑量下，除‘敖漢’苜蓿外，其他品種的SOD活性顯著高于對(duì)照，而450 Gy高劑量下，‘敖漢’的SOD活性顯著高于對(duì)照。除‘敖漢’外其他品種的SOD活性隨處理劑量的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而‘敖漢’苜蓿SOD活性變化與之相反；紫外線處理對(duì)苜蓿SOD活性變化表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)髙劑量抑制，且隨著處理紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，除‘Wega7F’SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)外，其他品種SOD活性均呈下降趨勢(shì)；EMS處理對(duì)4種苜蓿SOD活性的影響不顯著，SOD活性變化均隨處理劑量的增加而提高，低劑量處理下對(duì)SOD活性起抑制作用，高劑量下起促進(jìn)作用。

2.2 不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿POD活性的影響

由表2可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS處理對(duì)苜蓿POD活性的影響總體上表現(xiàn)為促進(jìn)作用，不同誘變處理之間的促進(jìn)程度不同，60Co-γ輻射對(duì)苜蓿影響為隨處理劑量的增加促進(jìn)程度下降，紫外線處理則是隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)POD活性增強(qiáng)，而EMS對(duì)苜蓿POD活性影響因品種不同而不同，對(duì)‘公農(nóng)1號(hào)’和‘WL319HQ’POD活性影響為隨EMS濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)另外2個(gè)品種的影響則是隨EMS濃度的增加而下降。整體來(lái)說(shuō)，150 Gy60Co-γ、90 min紫外線處理對(duì)苜蓿POD活性提高較大。

表2 誘變處理對(duì)苜蓿過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響 U/(g FW·min)

2.3 不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿CAT活性的影響

從表3中可知，苜蓿CAT活性在不同種類誘變處理下總體上表現(xiàn)為促進(jìn)作用大于抑制作用，苜蓿CAT活性變化隨60Co-γ處理劑量的提高呈下降趨勢(shì)，除對(duì)‘敖漢’苜蓿CAT活性表現(xiàn)低劑量促進(jìn)，高劑量(450 Gy)抑制外，對(duì)其他品種均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，‘公農(nóng)1號(hào)’、‘Wega7F’和‘WL319HQ’CAT的活性在紫外線處理下表現(xiàn)為隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，其中‘WL319HQ’的CAT活性提高最大，最大值為731.73 U/(g FW·min)，是對(duì)照的2.57倍，紫外線處理想‘敖漢’苜蓿的CAT活性呈現(xiàn)出高-低-高的變化趨勢(shì)，30、60 min紫外線處理抑制了‘敖漢’?！r(nóng)1號(hào)’、‘Wega7F’和‘WL319HQ’的CAT活性在EMS處理下呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，‘敖漢’苜蓿的CAT活性在0.1%和0.4%的EMS濃度下呈增加趨勢(shì)，且與對(duì)照達(dá)到差異顯著(P＜0.05)水平。

2.4 不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿MDA濃度的影響

從表4中可知，不同誘變處理下供試苜蓿品種細(xì)胞MDA濃度變化不顯著，多數(shù)誘變處理對(duì)MDA濃度的影響以增加為主。60Co-γ輻射處理提高了‘公農(nóng)1號(hào)’和‘Wega7F’的MDA濃度，150 Gy的60Co-γ輻射降低了‘WL319HQ’和‘敖漢’苜蓿的MDA濃度，低劑量紫外線處理下各品種MDA濃度下降，90 min紫外線處理下MDA濃度略有增加，除‘敖漢’苜蓿外，各品種在0.1%的EMS處理下MDA濃度均高于對(duì)照，且隨著EMS濃度增加MDA濃度呈下降趨勢(shì)，0.4%EMS處理下各品種的MDA濃度均下降。

表3 誘變處理對(duì)苜蓿過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響 U/(g FW·min)

表4 誘變處理對(duì)苜蓿丙二醛含量(MDA)的影響 μmol/g

2.5 不同誘變處理對(duì)紫花苜蓿可溶性蛋白含量的影響

由表5可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS處理后苜蓿植株葉片可溶性蛋白含量的影響不明顯，60Co-γ處理對(duì)各品種可溶性蛋白含量影響不同，‘公農(nóng)1號(hào)’在60Co-γ輻射處理下可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)表現(xiàn)為低促高抑，均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，在中、低濃度時(shí)，顯著促進(jìn)了敖漢可溶性蛋白含量的提高‘，Wega7F’和‘WL319HQ’可溶性蛋白含量受60Co-γ輻射影響較??；‘公農(nóng)1號(hào)’的可溶性蛋白含量在紫外線誘變處理下低于對(duì)照‘，Wega7F’‘、WL319HQ’和‘敖漢’在紫外線處理下可溶性蛋白含量表現(xiàn)為低濃度下降和高濃度提升；低濃度EMS處理抑制‘公農(nóng)1號(hào)’和‘Wega7F’可溶性蛋白含量，高濃度EMS處理促其含量增加，EMS處理提高了‘WL319HQ’可溶性蛋白含量，對(duì)‘敖漢’可溶性蛋白含量影響呈現(xiàn)為低促髙抑的變化趨勢(shì)。

2.6 不同誘變劑處理對(duì)苜?？扇苄蕴呛康挠绊?/h3>

由表6可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS對(duì)苜蓿植株葉片可溶性糖含量促進(jìn)作用大于抑制作用，‘公農(nóng)1號(hào)’和‘Wega7F’在60Co-γ處理下可溶性糖含量略低于對(duì)照，而‘WL319HQ’可溶性糖含量略高于對(duì)照，表明60Co-γ誘變處理對(duì)其有一定的促進(jìn)作用，而對(duì)‘敖漢’可溶性糖含量的影響表現(xiàn)為低濃度的抑制和高濃度的促進(jìn)；紫外線處理對(duì)‘公農(nóng)1號(hào)’、‘WL319HQ’和‘敖漢’可溶性糖含量的影響表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)而高劑量抑制，但紫外線處理對(duì)‘Wega7F’可溶性糖含量的表現(xiàn)為促進(jìn)作用；EMS處理對(duì)各品種可溶性糖含量影響各不相同。

2.7 不同誘變劑處理對(duì)苜蓿脯胺酸含量的影響

由表7可以看出，3種誘變處理對(duì)各品種苜蓿脯胺酸含量的影響不同，60Co-γ和紫外線處理對(duì)各品種苜蓿游離脯氨酸影響整體上表現(xiàn)為抑制程度高于促進(jìn)程度，450 Gy60Co-γ輻照下，苜蓿脯氨酸含量高于對(duì)照，‘公農(nóng)1號(hào)’和‘Wega7F’在紫外線處理下，游離脯胺酸含量明顯下降，‘WL319HQ’和‘敖漢’在紫外線處理下，低劑量下游離脯氨酸含量受到抑制作用，高劑量下受到促進(jìn)作用，EMS處理下‘公農(nóng)1號(hào)’和‘Wega7F’脯胺酸含量下降明顯，‘WL319HQ’和‘敖漢’脯胺酸含量提高，且隨濃度變化提高幅度不同。

表5 不同誘變處理對(duì)苜?？扇苄缘鞍缀康挠绊?mg/g

表6 不同誘變處理對(duì)苜?？扇苄蕴呛康挠绊?%

表7 不同誘變處理對(duì)苜蓿脯胺酸含量的影響 μg/g

3 討論

植物體內(nèi)的活性氧自由基清除劑含量的高低對(duì)植物抗逆性具有十分重要的意義，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)化物酶(POD)和過(guò)氧化氫化酶(CAT)三者在機(jī)體抵御脅迫損傷時(shí)相輔相成，共同發(fā)揮著保護(hù)作用[16]，為防止自由基傷害，使生物體內(nèi)自由基保持在一個(gè)低水平狀態(tài)下[17-19]。苜蓿在受到外界環(huán)境條件誘變刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基數(shù)量增加，這些自由基的產(chǎn)生會(huì)破壞正常的細(xì)胞代謝平衡及膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，加劇了膜脂過(guò)氧化作用，而細(xì)胞中的3種抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶、過(guò)化物酶和過(guò)氧化氫化酶能夠在機(jī)體抵御脅迫損傷時(shí)相輔相成，對(duì)細(xì)胞共同發(fā)揮保護(hù)作用[20-21]。本試驗(yàn)中，苜蓿SOD、POD和CAT活性在各誘變處理下總體上呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，說(shuō)明通過(guò)誘變可以提高苜蓿體內(nèi)3種抗氧化酶活性，抗氧化酶活性的增加有利于清除氧自由基，防御誘變損傷。誘變后各品種MDA的含量表現(xiàn)為，除個(gè)別誘變處理略有升高外，其他處理均低于對(duì)照，也進(jìn)一步說(shuō)明抗氧化酶活性提高對(duì)苜蓿細(xì)胞代謝平衡起到協(xié)調(diào)和保護(hù)作用，避免了苜蓿受誘變脅迫的傷害。

可溶性蛋白和可溶性糖都可以通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓來(lái)抵抗脅迫損傷，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。本試驗(yàn)中苜蓿植株葉片中可溶性蛋白和可溶性糖含量，既有顯著高于CK的，也有顯著低于CK的，其原因可能是：對(duì)于含量升高的苜蓿品種，可能是誘變處理造成苜蓿植株一定程度上的損傷，但其損傷仍在可調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，對(duì)于含量降低的苜蓿品種，可能是誘變處理對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，造成苜蓿體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖的部分降解，導(dǎo)致含量降低，形成不可修復(fù)的損傷。在正常生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量一般較低，而在受到外界環(huán)境條件逆境脅迫時(shí)，為了能夠維持細(xì)胞正常代謝和生理活動(dòng)，游離脯氨酸含量會(huì)大量積累，以抵御逆境的影響，為此，植物通過(guò)提高體細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量來(lái)防御逆境脅迫[17]。本實(shí)驗(yàn)中，高劑量的60Co-γ處理下，供試的各苜蓿品種的脯胺酸含量均高于對(duì)照處理，說(shuō)明苜蓿在遭受60Co-γ誘變輻射時(shí)，可以通過(guò)提高其體內(nèi)游離脯氨酸的積累，增強(qiáng)抵御逆境的能力；其他幾種誘變處理下，游離脯氨酸含量增減不一，說(shuō)明誘變對(duì)苜蓿游離脯氨酸的影響因處理劑量和品種不同而不同。

4 結(jié)論

本研究采用3種誘變處理對(duì)4個(gè)苜蓿品種進(jìn)行了誘變，通過(guò)分析當(dāng)代苜蓿誘變植株生理指標(biāo)可知，3種抗氧化酶活性增強(qiáng)，不同誘變處理對(duì)3種抗氧化酶活性的影響程度為POD提高最明顯，其次是CAT和SOD。丙二醛濃度受誘變處理影響不顯著，總體來(lái)說(shuō)，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和游離脯氨酸含量在各誘變處理下均有不同程度增加，但對(duì)各指標(biāo)含量影響因誘變處理劑量和苜蓿品種不同而不同。綜合分析酶活性及各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，可知150 Gy60Co-γ、90 min紫外線和0.4%EMS處理對(duì)苜蓿生理活性具有明顯提高作用。