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無色桿菌(Photorhabdusluminescens)為一種腸桿菌科，無色桿菌屬的革蘭氏陰性菌[1]，菌體細胞呈桿狀，大小為0.8～2.0 μm× 2.0～10.0 μm。目前，無色桿菌主要從土壤、植物以及昆蟲消化系統(tǒng)中分離得到，而國內(nèi)外對無色桿菌的研究主要集中在其降解有機污染物的能力及其協(xié)助昆蟲分解、利用有機物能力等方面的研究[2-5]，對無色桿菌的其他生物活性功能卻鮮有報道。美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL)，別稱“蜚蠊”，是一種在地球上至今已生存了3.5億年，當今世界上生命力最頑強、最古老的昆蟲群類之一。美洲大蠊具有繁殖速度快，棲息隱蔽，喜歡陰暗潮濕的角落等特點[6]，同時其可傳播多種致病微生物，是重要的病害傳播媒介，是衛(wèi)生防治的主要對象之一[7]。本研究從野生美洲大蠊腸道中分離得到4株無色桿菌，并發(fā)現(xiàn)其對黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎桿菌、大腸埃希菌等受試菌株的生長具有一定程度的選擇性抑制作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 室外捕捉的美洲大蠊成蟲樣品，經(jīng)廣東藥科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室老師鑒定，與美洲大蠊成蟲體貌特征相符合，鑒定為美洲大蠊(Periplanetaamericana)；枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯菌(ATCC 13883)、大腸埃希菌(ATCC 25922)以及黑曲霉菌(ATCC 16404)，所有受試菌株均購自廣東省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離及保存 采用表面消毒法對美洲大蠊進行預(yù)處理。剪去觸角、腿部和翅，從側(cè)面將蟲體的腹部切開并取出其腸道，放入勻漿器中，加入無菌水充分研磨，研磨液稀釋成分別為1×10-3g/mL、2×10-3g/mL以及4×10-3g/mL的3個濃度，每個濃度設(shè)置3個平行實驗室組。吸取充分研磨后的懸浮液0.2mL于高氏合成I號培養(yǎng)基平板上涂布均勻，并于恒溫箱中28 ℃倒置培養(yǎng)7 d。根據(jù)無色桿菌在瓊脂平板上的形態(tài)特征(菌落呈圓形，輕微隆起，淡黃色，濕潤，半透明，邊緣整齊，表面光滑)，挑取疑似單菌落接種于高氏合成I號培養(yǎng)基上進行二次純化、再培養(yǎng)。將純化后的菌株接種于菌液并與80%的甘油以1∶1的比例混勻，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌株的形態(tài)特征觀察 經(jīng)純化活化后的菌株在高氏合成I號培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)3 d，經(jīng)革蘭氏染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察細菌的的形態(tài)。

1.2.3菌株16S rDNA PCR擴增、Blast比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟，對所分離得到的菌株的基因組DNA進行提取。使用通用引物[8](27f：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；1492r：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T)對菌株的16S rDNA基因進行擴增。50 μL的反應(yīng)體系由2×Taq PCR Mix 25 μL，無菌ddH2O 20 μL，上、下游引物各2 μL，模板1 μL(空白對照組用無菌ddH2O代替，上述操作均在無菌條件下進行)。PCR擴增條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR產(chǎn)物序列檢測由上海英濰捷基公司完成。將測序所得的16S rDNA基因序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行Blast比對。將16S rDNA基因序列與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫blast比對的結(jié)果，利用Mega 7.0軟件，采用最大似然值法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行分析。

1.2.4菌株發(fā)酵粗體物抑菌活性的初步測定 挑取適當大小保存于平板的菌塊，加入到種子培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床160 r/min, 28 ℃搖瓶培養(yǎng)2d，按5%的接種量將種子液接種至ISP-2發(fā)酵培養(yǎng)基中，并置于恒溫搖床160 r/min，28 ℃搖瓶發(fā)酵7d。4000 r/min離心15 min后取上清，用等體積的乙酸乙酯對濾液萃取3次并收集上層有機相，旋蒸至干，稱量樣品的質(zhì)量，4 ℃保存?zhèn)溆?。?%的接種量把枯草芽孢桿菌等受試菌株接入到10 mL液體LB培養(yǎng)基(真菌采用液體沙氏培養(yǎng)基)中，置于恒溫搖床37 ℃，180 r/min培養(yǎng)8 h活化。在制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上加入5 mL混有適量受試菌液的固體LB培養(yǎng)基(受試菌最終濃度為1×10-8CFU/mL)。放入牛津杯，并向牛津杯中加入100 μL的待測樣品(濃度為1 mg/mL)，設(shè)ddH2O為空白對照。把平板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜，取走牛津杯，觀察其抑菌情況(每組實驗設(shè)置3個重復(fù)實驗)。

1.2.5菌株關(guān)鍵次級代謝生物合成基因和鹵化酶基因的擴增與鑒定 參考Christiansen G等方法[9-11]，在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索Helogenase、NRPS和PKSI的相關(guān)氨基酸序列，利用Clustal W軟件對其進行比對后，經(jīng)在線軟件Primer 5.0設(shè)計引物并用DNAman軟件對引物進行功能評估，獲得2個關(guān)鍵次級代謝生物合成基因NRPS(A3F：GCSTACSYSATSTACACSTCSGG；A7R：SASGT-CVCCSGTSCGGTAS)、PKS I(K1F：TSAAGTCSAACATCGGBCA；M6R：CGCAGGTTSCSGTACCAGTA)和鹵化酶基因FADH2(Halo-B4-FW：TTCCCSCGSTACCASATCGGSGAG；Halo-B4-RV：GSGGGATSWMCCAGWACCASCC)的PCR擴增引物序列。根據(jù)Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒的步驟抽提菌株的基因組DNA，并分別對3個關(guān)鍵合成酶基因進行PCR擴增，PCR體系總體積為25 μL：模板1.0 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR擴增條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 90 s/55 ℃ 2 min/59 ℃ 2 min (FADH2/NRPS/PKS I)，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié) 果

2.1菌株的形態(tài)特征觀察 菌株在高氏I號固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后的觀察其生長形態(tài)特征(圖1)，菌落均呈圓形、輕微隆起、濕潤。革蘭氏染色結(jié)果呈陰性，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體為微桿狀，菌絲呈直桿狀(圖1)，其生長形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果均符合無色桿菌的基本特征。

(A-B: WA5-1-11; C-D: WA5-1-16; E-F: WA5-1-17; G-H: WA5-1-54)圖1 4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌在高氏一號培養(yǎng)基生長形態(tài)及革蘭氏染色(×200)結(jié)果圖Fig.1 Growth morphology on the Gao’s No.1 medium and the Gram staining results of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

2.2菌株的分子生物學(xué)鑒定 對4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌的16S rDNA進行擴增，并在數(shù)據(jù)庫Ezbiocloud中進行Blast比對。比對結(jié)果顯示，4株菌株均為無色桿菌，且與無色桿菌Achromobacterxylosoxidans、Achromobacteraegrifaciens和Achromobactermarplatensis的相似度均在99.3%以上。選用Mega 7.0軟件，采用最大似然值法構(gòu)建4株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)4株菌株均與來自土壤的無色桿菌親緣關(guān)系較近。

2.3菌株抑菌活性測定 采用牛津杯法，對4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌發(fā)酵粗提物的抑菌活性進行初步測定(表1)。其中，菌株WA5-1-11對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌的生長具有抑制作用，菌株WA5-1-16對枯草芽孢桿菌以及黑曲霉菌的生長具有抑制作用，菌株WA5-1-17對枯草芽孢菌、金黃色葡萄球菌以及黑曲霉菌的生長具有抑制作用，菌株WA5-1-54對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以及肺炎克雷伯菌的生長具有抑制作用(圖3)。

2.4菌株關(guān)鍵次級代謝生物合成基因的鑒定情況 對4株無色桿菌的關(guān)鍵次級代謝生物合成基因PKS I(750 bp)、NRPS(900 bp)和鹵化酶基因FADH2(700 bp)進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示(表2)，4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌中均能檢測到2個關(guān)鍵次級代謝生物合成基因PKS I(750 bp)和NRPS(900 bp)，且在菌株WA5-1-54的檢測到鹵化酶基因FADH2(700 bp)。

圖2 4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌基于16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果圖Fig.2 The phylogenetic tree of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

表1 4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌抗細菌和抗真菌能力情況表(n=3)
Tab.1 Anti-bacterial and anti-fungi activity of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana(n=3)

受試菌株菌株WA5-1-11WA5-1-16WA5-1-17WA5-1-54枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (ATCC 6633)++++金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC 25923)+-++肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883)+--+大腸埃希菌Escherichia coli (ATCC 25922)+---黑曲霉菌Aspergillus niger (ATCC 16404)-++-

(+：抑菌圈≥ 9 mm；-：抑菌圈< 9 mm)

(A：枯草芽孢桿菌；B：金黃色葡萄球菌；C：肺炎克雷伯氏菌；D：大腸埃希菌；E：黑曲霉菌；1：WA5-1-11；2：WA5-1-16；3：WA5-1-17；4：WA5-1-54)圖3 4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌抗細菌和抗真菌結(jié)果圖Fig.3 The anti-bacterial and anti-fungi activity of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

表2 4株美洲大蠊腸道無色桿菌關(guān)鍵次級代謝生物合成基因與鹵化酶基因鑒定情況表(n=3)
Tab.2 The detection of the key secondary metabolic biosynthesis genes and Halogenase gene of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana (n=3)

菌株關(guān)鍵次級代謝生物合成基因PKS INRPSFADH2WA5-1-11++-WA5-1-16++-WA5-1-17++-WA5-1-54+++

(+：陽性；-：陰性)

3 討 論

腸道微生物作為昆蟲共生微生物的重要組成部分之一，近年來越來越多的研究表明，昆蟲腸道微生物對其宿主的生長、發(fā)育、抗逆抗藥乃至生存繁殖等方面都產(chǎn)生了十分重要的影響[12-15]。美洲大蠊為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬的昆蟲，其進化史十分漫長，是地球上起源最早、生命力最頑強的昆蟲類群之一[16]。美洲大蠊具有良好的環(huán)境適應(yīng)力與抗逆性，其作為多種病原微生物的傳播媒介，且其長期生活于不衛(wèi)生、陰暗潮濕的環(huán)境中，卻可免受病原生物的感染[17]。美洲大蠊的這些特征可能與其豐富的腸道微生物有關(guān)[18]。

本研究從美洲大蠊腸道中分離并得到了4株無色桿菌，根據(jù)沈敏雅[19]，Hinteregger C[20]等人的研究結(jié)果表明，目前國內(nèi)外對無色桿菌的研究主要集中在其降解有機污染物能力等方面[21-22]。本研究通過初步鑒定這4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等常見的病原菌均具有一定程度的選擇抑制作用，說明美洲大蠊良好的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性可能與其內(nèi)生無色桿菌具有的抑菌能力有關(guān)。微生物的大部分次級代謝產(chǎn)物是通過聚酮合酶(Polyketide Synthase, PKS)和非核糖體多肽合成酶(Non-ribosomal Peptide Synthetase, NRPS)途徑形成結(jié)構(gòu)模塊產(chǎn)生。同時，由PKS和NRPS途徑合成的化合物往往需要經(jīng)過如鹵化酶等修飾酶的結(jié)構(gòu)修飾后，從而成為結(jié)構(gòu)豐富的生物活性化合物[23-25]。因此，本研究對4株內(nèi)生無色桿菌的關(guān)鍵次級代謝生物合成基因PKS I、NPRS和鹵化酶基因FADH2進行鑒定，發(fā)現(xiàn)從4株無色桿菌中均能檢測到2個關(guān)鍵次級代謝生物合成基因，且在菌株WA5-1-54中檢測到鹵化酶基因FADH2。這說明了4株無色桿菌可能具有分泌產(chǎn)生某些抗菌生物活性物質(zhì)的能力。同時，在菌株WA5-1-54中檢測到鹵化酶基因FADH2，說明該菌株可能存在結(jié)構(gòu)豐富的天然活性物質(zhì)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)這4株美洲大蠊腸道內(nèi)生無色桿菌可能具有分泌某些抗菌天然活性物質(zhì)的能力，并在美洲大蠊適應(yīng)環(huán)境、抵抗外界病害入侵的過程中起到重要的作用。這為了解美洲大蠊的生活習(xí)性及其防治提供了一定的認識，也為后續(xù)對美洲大蠊腸道內(nèi)生菌天然活性產(chǎn)物的分離純化等相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)。