劉志強(qiáng)，彭宇，鄒崢，柯江維

(江西省兒童醫(yī)院，南昌 330006)

川崎?。↘awasaki disease，KD）又稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征 （mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS），臨床上以持續(xù)性發(fā)熱、口唇潮紅、球結(jié)合膜充血、手足硬腫脫屑等皮膚、黏膜、淋巴結(jié)的炎性癥狀為主要表現(xiàn)。KD是一種自限性的以全身性血管炎為主要病理改變的疾病，5歲以下小兒最常見于，多數(shù)預(yù)后良好，部分可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈受累，大量流行病學(xué)資料顯示川崎病引起的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥已成為發(fā)達(dá)國家兒童后天性心臟病最主要的病因[1]。KD的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，近年來研究表明，可能與一種或多種感染原觸發(fā)機(jī)體的異常免疫應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)。IL-17A是一種重要的促炎因子，Th17細(xì)胞和γδT17細(xì)胞是目前已知的主要的分泌IL-17A的細(xì)胞。本研究通過分析KD患兒外周血Th17細(xì)胞、γδT17細(xì)胞及其產(chǎn)生的IL-17A的變化，探討Th17細(xì)胞、γδT17細(xì)胞與KD炎癥損傷的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2017年9月來我院風(fēng)濕免疫科住院治療的川崎病患兒107例作為病例組，其中男65例，女42例，平均年齡2.7歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：符合川崎病或不完全川崎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。另選同期來我院門診體檢的健康兒童63例作為對(duì)照組，其中男37例，女26例，平均年齡2.9歲。兩組間兒童的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)征得家長的同意并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 TD5A-WS離心機(jī) （湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器離心機(jī)有限公司），F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司），酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），洗板機(jī)（安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），恒溫孵育箱（美國賽默飛世爾科技有限公司），PE anti-human TCRγδ （美國 BD 公司），Alexa Fluor 488偶聯(lián) anti-human IL-17A McAb（美國BD公司），PerCP anti-human CD3 McAb （美國BD公司），PE anti-human CD4 McAb （美國BD公司），Human IL-17A ELISA Kit(杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血Th17細(xì)胞、γδT17細(xì)胞的分析 所有研究對(duì)象入院時(shí)采集靜脈血2ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液出單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，取1ml細(xì)胞懸液鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯(終濃度50ng/ml)、離子霉素(終濃度 1μg/ml)及莫能菌素(終濃度10μg/ml)吹打混勻，置于37℃、5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5h。收集培養(yǎng)后的各組細(xì)胞于流式上樣管中，1000r/min離心5min，洗滌后用PBS重懸。取30μl細(xì)胞懸液加入到一流式上樣管中，分別加入PerCP anti-human CD3 McAb及PE anti-human TCRγδ各 5μl進(jìn)行胞外染色，另取 30μl細(xì)胞懸液加入到另一流式上樣管中，分別加入PerCP antihuman CD3 McAb及PE anti-human CD4 McAb各5μl進(jìn)行胞外染色，室溫避光孵育20min；PBS洗滌后加入細(xì)胞固定劑和破膜劑，加入Alexa Fluor 488偶聯(lián)anti-human IL-17A McAb，室溫避光孵育20min，PBS洗滌后加500μl PBS重懸細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和同型對(duì)照組；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所有數(shù)據(jù)采用FACSDiva軟件分析。

1.3.2 血清IL-17A測(cè)定 所有研究對(duì)象入院時(shí)用普通管采集靜脈血1ml，3000r/min離心3min分離后得到血清，放-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-17A表達(dá)水平。嚴(yán)格按照試劑盒步驟要求進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)算標(biāo)本的OD值所對(duì)應(yīng)的濃度值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對(duì)照組外周血 γδT、γδT17、Th17、Th細(xì)胞含量的比較 γδT、γδT17、Th17細(xì)胞在病例組外周血CD3+T細(xì)胞中的比例 (11.94±2.37、3.71±1.66、1.82±0.66)顯著高于對(duì)照組(7.01±0.61、1.22±0.51、0.62±0.28)（P＜0.05），Th 細(xì)胞在病例組外周血CD3+T細(xì)胞中的比例（63.25±9.96）與正常對(duì)照組比例（61.98±2.77）相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 見表1。

表1 病例組和對(duì)照組γδT、γδT17、Th17、Th細(xì)胞含量的比較（x±s）

2.2 病例組和對(duì)照組血清IL-17A含量的比較IL-17A 在病例組血清中的含量（11.26±3.51ng/l）顯著高于對(duì)照組中的含量 （4.39±1.07ng/l）（P＜0.05）。見表2。

表2 病例組和對(duì)照組外周血IL-17A水平比較（x±s）

3 討論

根據(jù)TCR不同，T細(xì)胞可分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞兩大類。 αβT細(xì)胞（包括 CD4+、CD8+T細(xì)胞）是參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要T細(xì)胞群體，約占CD3+T細(xì)胞的90%～95%。γδT細(xì)胞（CD4-T細(xì)胞）是一類重要的固有免疫細(xì)胞，其百分?jǐn)?shù)僅為CD3+T細(xì)胞的1%-10%，與αβT細(xì)胞不同，γδT細(xì)能更快地啟動(dòng)宿主體內(nèi)免疫應(yīng)答。αβT細(xì)胞的TCR識(shí)別抗原是主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility-complex，MHC)類分子限制性。 而人的γδT細(xì)胞不表達(dá)譜系標(biāo)記，對(duì)抗原的識(shí)別也無需MHC分子的輔助，即無MHC限制性。

γδT細(xì)胞具有各種生物學(xué)效應(yīng)，其主要的效應(yīng)特點(diǎn)是溶解靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和分泌不同種類的細(xì)胞因子和趨化因子。γδT細(xì)胞還被認(rèn)為是偶聯(lián)固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，與NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞共同構(gòu)成機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防御屏障[3]。γδT細(xì)胞作為免疫反應(yīng)早期IL-17A的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染疾病快速進(jìn)展者中，VδT細(xì)胞的比例顯著增高，并引起HIV感染者CD4+T細(xì)胞減少，進(jìn)而加速疾病進(jìn)展[4]。劉紅利等[5]研究發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者的γδT細(xì)胞通過表達(dá)共刺激分子CD40L和ICOS為B細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號(hào)輔助其產(chǎn)生抗體，提示γδT細(xì)胞在橋本甲狀腺炎的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。Daguzan等[3]發(fā)現(xiàn)巨細(xì)胞病毒感染后，γδT細(xì)胞在數(shù)目明顯增多，提示巨細(xì)胞病毒感染影響和改變了T細(xì)胞亞群的分布。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，KD患兒γδT細(xì)胞的比例顯著增加，而Th細(xì)胞無明顯差異?；仡櫥純翰∈罚純杭性诎l(fā)熱持續(xù)3-5d就診，尚處于疾病早期，而γδT細(xì)胞是一類重要的固有免疫細(xì)胞，它們能更快地（數(shù)小時(shí)內(nèi)）啟動(dòng)宿主體內(nèi)免疫應(yīng)答，且只需少量細(xì)胞就能發(fā)揮重要作用。因此我們認(rèn)為KD患兒發(fā)病早期γδT細(xì)胞發(fā)生了高度活化，γδT細(xì)胞參與了KD早期的炎癥反應(yīng)。

IL-17A是一種促炎因子，主要由T細(xì)胞誘導(dǎo)合成，是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，能夠募集中性粒細(xì)胞，促使T細(xì)胞激活，還可以促使上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌IL-6、IL-8等刺激因子，加重局部炎癥反應(yīng)[6]。王振杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少癥患者血清中IL-17、IL-12表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組人員；提示介導(dǎo)自身免疫的IL-17等炎性因子表達(dá)水平和風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少癥患者的造血細(xì)胞炎性受損相關(guān)病變過程關(guān)系密切。帥可鑫等[8]對(duì)過敏性紫癜患兒隨訪時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組患兒血清IL-17明顯高于非復(fù)發(fā)組，提示IL-17可以用來檢測(cè)過敏性紫癜患兒病情。劉嵐等[9]亦研究發(fā)現(xiàn)IL-17可能參與了巨細(xì)胞病毒性肝炎的發(fā)病過程，在病毒性肝炎的發(fā)病過程中具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，KD患兒血清IL-17A的含量顯著增加，高水平IL-17A與KD的發(fā)病密切相關(guān)。IL-17A作為促炎因子參與了KD發(fā)生，對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)，可以為KD的炎癥干預(yù)提供有效依據(jù)。

Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一類T細(xì)胞亞群，可通過分泌 IL-17 （IL-17A）、IL-17E、IL-6、IL-21 等來促進(jìn)自身免疫性炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]。一直以來Th17細(xì)胞被認(rèn)為是IL-17A的主要來源。苗靜[11]等研究發(fā)現(xiàn)，過敏性紫癜患兒急性期血漿IL-17水平增高，Th17細(xì)胞功能增強(qiáng)；Th17細(xì)胞和IL-17共同參與兒童過敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Thl7細(xì)胞的作用機(jī)制并不能解釋宿主免疫早期起重要作用的IL-17的產(chǎn)生?，F(xiàn)在已知產(chǎn)生IL-17A的適應(yīng)性免疫細(xì)胞主要包括Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞[12]；產(chǎn)生IL-17A的固有樣淋巴細(xì)胞主要包括γδT細(xì)胞和NKT細(xì)胞，其中γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A的數(shù)量甚至超過Th17細(xì)胞[13]。在過敏性哮喘患者的γδT細(xì)胞中IFN-γ+/IL-17A+比例大幅度降低[14]，說明γδT細(xì)胞可能通過分泌IL-17A細(xì)胞因子參與哮喘的發(fā)病。薛春雪等[15]研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞有可能以γδTCR非依賴的作用方式活化，并通過釋放IL-17A參與H1N1重癥感染小鼠早期肺組織炎性損傷過程。徐玲[16]等研究亦發(fā)現(xiàn)，巨細(xì)胞病毒感染組IL-17水平較對(duì)照組升高，其表達(dá)水平與γδT細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，提示γδT細(xì)胞可能也參與了巨細(xì)胞病毒感染患兒IL-17的產(chǎn)生。我們研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康對(duì)照組，γδT17細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例在病例組中明顯升高，表明γδT17細(xì)胞和Th17細(xì)胞均參與了KD早期的炎癥反應(yīng)。有研究表明，當(dāng)有炎性因子存在時(shí)，Th17細(xì)胞由CD4+T淋巴細(xì)胞分化，并促進(jìn)細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生，這類炎癥因子主要是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β）[17]。歷風(fēng)元等[18]研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病模型組肺組織中TGF-β1的含量較對(duì)照組肺組織明顯升高。Peters等[19]在研究肺纖維化時(shí)證實(shí)IL-17通過誘導(dǎo)TGF-β和膠原蛋白產(chǎn)生直接促進(jìn)肺纖維化。因此，我們認(rèn)為Th17細(xì)胞的增多可能是因?yàn)棣忙腡17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A通過TGF-β對(duì)其的趨化募集作用所致[20]。

雖然對(duì)IL-17A研究主要集中在Th17細(xì)胞，但是γδT細(xì)胞及其分泌的IL-17A在炎癥反應(yīng)方面的作用越來越受重視，至今它們?cè)趦和疜D中的作用尚未完全明確。今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究Th17細(xì)胞和γδT細(xì)胞及IL-17A在兒童KD中的發(fā)病機(jī)制，為臨床炎癥干預(yù)和開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。