胡曉苗，張丹俊，戴 銀，趙瑞宏，潘孝成，周學(xué)利，侯宏艷，沈?qū)W懷，朱傳明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)易發(fā)生點(diǎn)突變引起抗原漂移，不同亞型毒株同源重組，引起抗原頻繁變異，產(chǎn)生眾多血清亞型[1]。因此，對(duì)禽流感的有效防控一直都面臨極大的挑戰(zhàn)。H9N2亞型AIV在中國(guó)家禽中呈地方流行性并呈蔓延趨勢(shì)，如果繼發(fā)感染其他病原，則病死率大大升高，同時(shí)還可作為H5N1、H7N9和H10N8的新型人類(lèi)禽流感病毒的基因供體，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[2-4]。國(guó)內(nèi)已經(jīng)使用Ck/SD/6/96和Ck/SH/F/98等作為疫苗株[5]來(lái)防控H9N2禽流感。然而，在巨大的疫苗壓力和環(huán)境選擇下，H9N2病毒在已經(jīng)接種疫苗的雞群中仍然不斷發(fā)生著抗原漂移[6-9]，人們迫切需要了解當(dāng)前流行毒株的抗原特性和常用疫苗對(duì)這些病毒的保護(hù)效率。

本試驗(yàn)選取2012年—2015年我國(guó)安徽省分離的24株H9N2亞型AIV進(jìn)行HA基因序列測(cè)定、遺傳演化分析和抗原位點(diǎn)分析，選取1株流行株與疫苗株F98進(jìn)行抗原差異分析，以了解當(dāng)前H9亞型AIV變異動(dòng)向及抗原性變化，為H9禽流感疫苗的評(píng)估和使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和雞胚 本試驗(yàn)中使用的24株H9N2亞型AIV分離毒株，2012年—2015年間自安徽省家禽養(yǎng)殖場(chǎng)和活禽市場(chǎng)中分離；疫苗毒株為 A/chicken/Shanghai/F/98(F株)[8]，揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供；無(wú)特定病原體(SPF)種蛋，購(gòu)自北京梅里亞公司，由安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室實(shí)驗(yàn)室孵育至9日齡～11日齡。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；RNA酶A、dNTPs、DNA Marker、RNA提取試劑盒、DNA Gel Extraction Kit (AxyPrep)，Axygen公司產(chǎn)品；RNA酶抑制劑(RNasin)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.1.3 引物 反轉(zhuǎn)錄引物為5′-AGCAAAAGCAGG-3′;HA基因擴(kuò)增的通用引物1對(duì)，P1：5′-AGCGAAAGCAGGGG-3′;P2：5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′;引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 擴(kuò)增HA基因片段 用病毒RNA提取試劑盒抽提病毒總RNA。用反轉(zhuǎn)錄引物和反轉(zhuǎn)錄酶(A-MLV)對(duì)病毒RNA反轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，HA基因擴(kuò)增的通用引物P1/P2特異性擴(kuò)增出HA基因片段。將PCR回收產(chǎn)物連同PCR引物，送金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2 HA基因的測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)繪制 含HA基因的PCR產(chǎn)物由南京金斯瑞有限公司測(cè)序。采用Lasergene 7.1軟件進(jìn)行HA基因序列編輯和翻譯；用Mega5.1軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 流行株A/chicken/Anhui/20150416/2015和疫苗株F98滅活疫苗的交叉免疫保護(hù)試驗(yàn) 收集A/chicken/Anhui/20150416/2015(AH0416)和F98毒株感染雞胚的尿囊液，用3.5 mg/mL甲醛滅活72 h，與白油混和均勻，制成油乳劑疫苗。將36只3周齡SPF雞隨機(jī)分為6組，每組6只，隔離飼養(yǎng)；其中2組接種F98株禽流感滅活油乳疫苗(0.2 mL/只)，2組接種H9亞型流行株AH0416株禽流感滅活油乳疫苗(0.2 mL/只) ，另外2組接種滅菌PBS (0.2 mL/只)作為對(duì)照。21 d后采集各組雞的血清，分別以F98和AH0416作為抗原，測(cè)定血凝抑制 (HI) 抗體效價(jià)(以log2表示)；免疫同種疫苗的2組動(dòng)物分別用F98和AH0416毒株經(jīng)鼻腔途徑攻毒，同時(shí)接種PBS對(duì)照組，劑量為每只雞106EID50/0.1 mL。攻毒后第3、5、7天，采集喉頭和泄殖腔拭子樣品。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)排毒情況 用試劑盒提取交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)所采集棉拭子樣品中的病毒RNA，用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)樣品中是否存在H9N2病毒的核酸，參照文獻(xiàn)[10]實(shí)施。分別統(tǒng)計(jì)各組雞的排毒情況。

2 結(jié)果

2.1 HA基因的序列分析

對(duì)24株分離株HA基因測(cè)序分析顯示，HA基因全長(zhǎng)為1 683 bp，共編碼560個(gè)氨基酸，與H9亞型禽流感病毒華東地區(qū)經(jīng)典株A/Chicken/Shanghai/F/98(F98)相比，無(wú)核苷酸的插入或缺失。本研究24個(gè)毒株HA基因核苷酸同源性在94.5%～99.9%之間，與Dk/HK/Y280/97的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸同源性分別在90.5%～94.8%和91.6%～95.8%之間，與Ck/SH/F/98的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸同源性分別在89.8%～91.6%和92.0%～93.8%之間，相比較而言，本研究的24個(gè)毒株HA基因與Dk/HK/Y280/97(Y280-lik)的同源性更高，說(shuō)明與Y280-like的遺傳距離更近，具有相同起源。

根據(jù)完整的HA基因編碼的氨基酸序列繪制HA基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，由圖1可看出，本研究的所有毒株均屬于Y280-like。但是，除了2株2014年的分離株外，所有分離株都聚集在與Y280-like遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的分支上，與上述氨基酸同源性分析結(jié)果一致，說(shuō)明H9N2亞型病毒在中國(guó)正持續(xù)進(jìn)化，趨于形成穩(wěn)定的分支。2012年—2015年的毒株在遺傳進(jìn)化樹(shù)上的分布較集中，說(shuō)明病毒之間的遺傳進(jìn)化距離比較近，在這4年間病毒并未發(fā)生大的遺傳變異。但與常用的疫苗株F98已有了較大的遺傳差異。

2.2 HA基因抗原位點(diǎn)變異分析

在24株H9N2禽流感病毒HA1所有變異的氨基酸中包含部分抗原位點(diǎn)。本研究以文獻(xiàn)[11]人H3亞型流感病毒A/Achi/2/68毒株的HA基因氨基酸序列作為參照，推導(dǎo)并比較了本研究毒株HA基因的幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸序列，再根據(jù)A/Swine/HongKong/8/98 HA晶體結(jié)構(gòu)模型[12]，對(duì)這些毒株HA1的變異位點(diǎn)進(jìn)行歸類(lèi)，結(jié)果表明，2012年—2015年間發(fā)生禽流感病毒的氨基酸位點(diǎn)變異主要集中在與H3亞型相對(duì)應(yīng)的C、D和E 3個(gè)抗原變異區(qū)，而A和B位點(diǎn)相對(duì)保守(表1)。

◆.毒株；●.F98疫苗株；▲.Y280株；◇.試驗(yàn)用株

◆.Strains; ●.F98 vaccine strain; ▲.Y280 strain; ◇.Experiment strain

圖1 HA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.3 交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)

AH0416于2015年從雞體分離，根據(jù)HA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示，該分離株與F98的遺傳距離最遠(yuǎn),且為近年分離的毒株，故選取其與疫苗株F98進(jìn)行交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)流行株抗原性的變化。對(duì)3周齡SPF雞接種H9亞型AH0416株禽流感滅活疫苗21 d后，產(chǎn)生的針對(duì)AH0416株和F98株的HI抗體效價(jià)分別為8.36 log2和7.16 log2，接種H9亞型F98株疫苗21 d后，產(chǎn)生的針對(duì)AH0416株和F98株的HI抗體效價(jià)分別為7.53 log2和 8.09 log2(表2)。結(jié)果表明,H9滅活疫苗免疫，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的中和免疫毒株的血清抗體(大于8 log2)，但對(duì)遺傳距離較遠(yuǎn)的異源病毒的中和效價(jià)要低1個(gè)～2個(gè)滴度，說(shuō)明隨著H9N2病毒不斷進(jìn)化，其抗原性也隨之發(fā)生改變。

表2 F98與AJ3株之間交叉血凝抑制結(jié)果

H9病毒滅活苗對(duì)SPF雞的保護(hù)效率見(jiàn)表3。F98株攻毒后，F(xiàn)98疫苗可以保護(hù)SPF雞不排毒，免疫組攻毒第3天的喉頭排毒率為33.33%(2/6)，泄殖腔排毒率為33.33%(2/6)；第5天的喉頭排毒率為16.67%(1/6)，泄殖腔排毒率為33.33%(2/6)，第7天停止排毒；PBS對(duì)照組第3天喉頭和泄殖腔的排毒率為100%(6/6)，第5天喉頭的排毒率為50%(3/6)，泄殖腔排毒率為100%(6/6)。AJ3株攻毒后，AH0416疫苗可以保護(hù)SPF雞不排毒；F98株攻毒第3天的喉頭排毒率為33.33%(2/6)，泄殖腔排毒率為1/6;第5天的喉頭排毒率為16.67%(1/6)，泄殖腔排毒率為50%(3/6)，第7天停止排毒；PBS對(duì)照組第3天喉頭和泄殖腔的排毒率為100%(6/6)，第5天喉頭的排毒率為50%(3/6)，泄殖腔排毒率為83.33%(5/6)(表3)。排毒情況與交叉血凝試驗(yàn)結(jié)果一致，證明流行株的抗原性已經(jīng)發(fā)生了變化，F(xiàn)98疫苗對(duì)其無(wú)法提供完全保護(hù)。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有報(bào)道認(rèn)為當(dāng)前H9N2亞型AIV流行毒株已經(jīng)發(fā)生了顯著變化， 現(xiàn)有疫苗已經(jīng)不能產(chǎn)生完全免疫保護(hù)[13]。本研究對(duì)2012年—2015年期間從安徽地區(qū)雞群分離的24株流行毒株所進(jìn)行的HA基因測(cè)序分析，結(jié)果24株與Dk/HK/Y280/97的同源性更高，與Y280-like的遺傳距離更近，具有相同起源。根據(jù)HA基因ORF編碼的氨基酸序列繪制HA基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，本研究的所有毒株均屬于Dk/HK/Y280/97-like，但與Dk/HK/Y280/97遺傳進(jìn)化距離比較遠(yuǎn)。除了2014年的2株與Y280遺傳距離較近之外，其他毒株都聚集在較遠(yuǎn)的獨(dú)立分支，說(shuō)明2012年—2015年的H9N2病毒正在不斷進(jìn)化，近年來(lái)形成的分支與之前的Y280株已有了較大的遺傳差異。對(duì)這些毒株HA1的變異位點(diǎn)進(jìn)行歸類(lèi)，結(jié)果表明，發(fā)生的氨基酸變異位點(diǎn)主要集中在與H3亞型相對(duì)應(yīng)的C、D和E3個(gè)抗原變異區(qū)，共有28個(gè)氨基酸發(fā)生變化，預(yù)示著流行株的抗原特性可能發(fā)生了一些改變。

為了研究當(dāng)前流行株與疫苗株F98之間的抗原差異，本研究選取一株遺傳進(jìn)化樹(shù)中距離F98株最遠(yuǎn)的分離株AH0416，用其和F98株進(jìn)行交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)滅活疫苗免疫對(duì)同種病毒可以提供完全保護(hù)，而不能完全阻斷異種H9N2病毒的排毒。表明當(dāng)前的流行毒株AH0416是一株抗原變異株，在基因水平上發(fā)生的變異已經(jīng)累計(jì)到抗原性的變化，常用的疫苗已經(jīng)不能提供完全保護(hù)。加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型禽流感病毒生物學(xué)特性和分子流行病學(xué)研究，掌握其遺傳變異規(guī)律，研發(fā)合適的新型疫苗，對(duì)于科學(xué)防控H9N2禽流感意義重大。

表3 H9病毒滅活疫苗對(duì)SPF雞的保護(hù)效率

注：C.泄殖腔，T.喉頭。

Note：C.Cloaca，T.Larynx.