殷銀霞，劉永華，吳玉泓，謝守嬪，程小麗，田一虹，王園園，李海龍

(1. 北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518116； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 370000； 3. 甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院， 蘭州 730000； 4. 甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000； 5. 蘭州市第一人民醫(yī)院， 蘭州 730000)

潰瘍性結腸炎是以腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血樣便為主的常見炎癥性腸病。前期研究表明[1]，理中湯合四神丸中藥復方顆粒可抑制MyD88、IRAK1的表達,影響MyD88信號通路的傳導, 達到治療脾腎陽虛型UC的目的。在UC等炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中，腸道屏障受損，腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)表現(xiàn)出趨化因子的差異性表達[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，在結腸炎結腸組織活檢中的同一趨化因子組占總黏膜反應的主導地位，UC組的表達更為明顯。因此，趨化因子在潰瘍性結腸炎中起著重要作用。為進一步驗證其在脾腎陽虛型UC發(fā)病機制中的調(diào)控作用，本實驗基于第二代測序技術篩選脾腎陽虛型UC的差異表達基因，觀察趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)中相關趨化因子的基因的表達變化情況，從中尋找溫補脾腎法中藥治療潰瘍性結腸炎的特異性靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠96只，雌雄各半，體重(170±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供【SCXK(甘)2015-0002】，飼養(yǎng)于實驗中心SPF級環(huán)境內(nèi)【SYXK(甘)2015-0005】。所有操作均符合實驗動物倫理原則(倫理審批號：2015-079)。

1.1.2 藥物、試劑

大黃水煎液(甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，批號20170306)，氫化可的松注射液(國藥集團容生制藥有限公司，批號1406418-A11)，三硝基苯磺酸(Sigma公司，批號SLBP08899 V)，柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信誼制藥公司，批號09141010)，RNAiso PLUS 熒光定量試劑盒(美國Promega公司，批號0000231060)，理中湯合四神丸復方顆粒(甘肅眾友健康醫(yī)藥股份有限公司，批號20140721)，4%多聚甲醛(北京Solarbio公司，批號20160315)，逆轉錄試劑盒(美國Promega公司，批號0000232248)，CXCL1基因上下游引物(批號：CHPN132-05/ CHPN132-06)，CXCL2基因上下游引物(批號：CHPN132-07/ CHPN132-08)，CXCL6基因上下游引物(批號：CHPN132-03/ CHPN132-04)，CCL7基因上下游引物(批號：CHPN132-11/ CHPN132-12)，CCL12基因上下游引物(批號：CHPN132-13/ CHPN132-14)，CXCR2基因上下游引物(批號：CHPN132-01/ CHPN132-02)，所有引物均由大連寶生物工程有限公司提供。

1.1.3 實驗設備

電子天平(德國賽多利斯，CPA124S)，臺式高速冷凍離心機(凱達集團成員高科技公司，TGL16 M)，實時熒光定量PCR(美國Bio-rad公司，CFX96)，高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備工程公司，CT14RD)。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗

將96只Wistar大鼠雌雄各半分開按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、SASP組雌雄各8只(造模成功后分組給藥治療模型組不給藥)。本研究采用本課題組前期的研究成果所建立的脾腎陽虛型UC病證結合模型制備方法[5]復制脾腎陽虛型UC大鼠模型。造模成功后，第2天開始灌胃給藥，1次/日，連續(xù)21 d。根據(jù)體型系數(shù)，大鼠給藥劑量換算為成人劑量之10、5、2.5倍，即高、中、低劑量給藥劑量分別為13.5，6.75，3.375 g/kg的生藥劑量，SASP組為0.2 g/kg，空白組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，體積為10 mL/kg。觀察大鼠每天的精神、飲食、毛發(fā)色澤、大便性狀等情況，記錄各組大鼠體重，1次/周。模型組大鼠在造模14 d末、其他各組大鼠在用藥21 d末，禁食24 h，用水合氯醛麻醉后，打開腹腔，剪取8 cm結腸組織，沿縱軸剪開，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，置于濾紙上吸干水分，根據(jù)Strober等[6]提出的大鼠結腸黏膜損傷評分標準，觀察各組大鼠黏膜組織的充血、水腫、潰爛程度進行評分。留取病變的結腸組織，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)HE染色后制作病理切片，另一部分用凍存管保存于-80℃超低溫冰箱，將用于后期檢測。

1.2.2 病理切片的制備、觀察

取出固定于4%多聚甲醛溶液中的病變結腸組織，石蠟包埋后制作病理切片，再進行HE染色。參照Geboes 等[7]提出的評分標準，在光學顯微鏡下對切片進行觀察評分。

1.2.3 高通量測序

分別選取空白組大鼠結腸組織與模型組大鼠病變部位結腸組織進行高通量測序，高通量測序以及基因差異表達分析、差異表達基因GO富集分析和Pathway富集分析由上海伯豪生物技術有限公司完成。根據(jù)q-value0.05,Fold-change1.5的條件篩選差異基因。

1.2.4 Real Time-qPCR法檢測差異表達基因

常規(guī)提取RNA，合成cDNA。各基因的上下游引物序列、產(chǎn)物長度如表 1。擴增反應：總體系為10 μL，預變性，PCR反應循環(huán)40次，溶解，每個樣本重復4孔，PCR反應結束后分析熔解曲線，判斷擴增產(chǎn)物是否有非特異性擴展；分析擴增曲線，得出CT值，按照相對定量法調(diào)用機器附帶軟件包計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

表 1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for each gene

2 結果

2.1 一般生存情況

模型組大鼠普遍精神不佳、畏寒扎堆，進食量下降，毛發(fā)疏散、色澤枯槁，出現(xiàn)黏液、膿血大便，體重下降。空白組大鼠表現(xiàn)如常。各治療組大鼠經(jīng)治療后普遍好轉，精神轉佳，反應靈活，活動增加，飲食增加，除個別大便偏軟，其余基本成形，毛發(fā)出現(xiàn)光澤。(大鼠死亡情況：模型組3只，高劑量組2只，中劑量組1只，低劑量組1只，SASP組3只)。

2.2 大鼠結腸黏膜組織形態(tài)學變化

2.2.1 肉眼觀察空白組與模型組大鼠結腸黏膜組織形態(tài)變化

模型組大鼠黏膜充血水腫、腸壁增厚，可見潰瘍及糜爛。與正常的空白組大鼠結腸組織相比較，模型組大鼠結腸組織評分為(4.67±0.58)，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2.2 光學顯微鏡下觀察空白組與模型組大鼠結腸組織病理切片結果

模型組大鼠結腸組織可見黏膜層及黏膜下層有大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，肌層見膠原纖維與成纖維細胞形成的肉芽組織，部分上皮組織脫落、壞死?？瞻捉M大鼠結腸組織黏膜層組織完整，可見黏膜表面的單直管狀腺體，基本未見炎癥細胞浸潤。見圖1。

注：A) 模型組大鼠結腸組織病理切片結果；B) 空白組大鼠結腸組織病理切片結果。圖1 病理切片結果Note. A) Rat model group. B) Rat blank group.Figure 1 pathological changes in the rat colon tissues

按照鏡下大鼠結腸黏膜組織損傷評分標準進行評分，與空白組相比較，模型組大鼠評分為(13.67±0.58)，差異具有顯著性(P< 0.01)。

2.3 大鼠結腸組織樣本總RNA質(zhì)量控制

對送檢的大鼠結腸組織樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，各樣本RNA在18 s、28 s處見明顯峰值(見圖2)，RIN(RNA完整系數(shù))≥6.0且28 s/18 s≥0.7，說明RNA樣本無真核或原核生物污染；無DNA或蛋白污染；無過多的5 s rRNA。質(zhì)檢結果類別為A1，符合電泳結果，總量達2次及以上，可進行后續(xù)實驗。

圖2 RNA樣本電泳圖Figure 2 RNA electrophoregram

2.4 空白組大鼠與模型組大鼠相應結腸組織基因的差異性表達分析

根據(jù)高通量測序結果，與模型組大鼠相比較，根據(jù)q-value0.05，F(xiàn)old-change1.5篩選出空白組大鼠差異表達的基因216個，其中下調(diào)166個和上調(diào)84個。相對于模型組大鼠，表達下調(diào)的基因明顯多于表達上調(diào)的基因，表達下調(diào)的基因數(shù)目是表達上調(diào)的1.96(166/84)倍。兩組之間的差異表達基因用火山圖(見圖 3)，可以大致顯示出差異表達基因上調(diào)、下調(diào)的數(shù)量情況以及所占全部基因的比率。

2.5 差異表達基因的GO分析結果

將篩選出來的差異表達基因進行生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)三個層次的統(tǒng)計分析，其中BP 3158個、CC 1863個、MF 695個，見圖 4所示。

2.6 差異表達基因Pathway分析結果

Pathway分析結果顯示，差異表達mRNA主要富集于細胞因子受體相互作用、吞噬小體、ECM-受體相互作用、TNF信號通路、細胞粘附分子、脂肪細胞因子信號通路、抗原加工提呈、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、腫瘤轉錄調(diào)控失調(diào)、炎癥性腸疾病、MAPK信號通路、細胞黏附、白細胞跨內(nèi)皮遷移、錯配修復、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、Nod樣受體信號通路等炎癥相關通路，見表2。

2.7 大鼠結腸組織趨化因子mRNA的表達

RT-qPCR法檢測結果顯示：與空白組結腸組織比較，模型組中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達量明顯提高，差異有顯著性(P< 0.01);與模型組結腸組織相比較，各治療組中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達量明顯下降，差異有顯著性(P< 0.01)；與測序結果一致。(見表3)

注：紅色表示上調(diào)差異基因，藍色表示下調(diào)差異基因。圖3 空白組與模型組大鼠結腸組織基因的差異性表達分析Note. Red indicates upregulated genes, blue indicates downregulated genes.Figure 3 Differentially expressed genes

圖4 差異表達基因的GO功能分類統(tǒng)計圖Figure 4 Gene Ontology classifications of the differentially expressed genes

信號通路Pathways基因數(shù)Diff gene in this pathway富集程度rich_factorPQ-valuerno04060:Cytokine-cytokine receptor interaction193.30 1.00E-057.27E-04rno04145:Phagosome112.57 3.89E-037.07E-02rno04062:Chemokine signaling pathway112.37 7.18E-038.24E-02rno04514:Cell adhesion molecules (CAMs)92.37 1.32E-021.25E-01rno04512:ECM-receptor interaction73.44 2.74E-036.65E-02rno04668:TNF signaling pathway72.44 2.02E-021.63E-01rno03320:PPAR signaling pathway62.99 1.01E-021.00E-01rno04621:NOD-like receptor signaling pathway42.67 3.89E-022.42E-01rno04920:Adipocytokine signaling pathway42.07 9.64E-024.29E-01rno04620:Toll-like receptor signaling pathway51.99 9.06E-024.11E-01rno04612:Antigen processing and presentation41.96 1.16E-014.86E-01rno04151:PI3K-Akt signaling pathway161.90 1.55E-021.30E-01rno04630:Jak-STAT signaling pathway71.79 9.79E-024.27E-01rno05321:Inflammatory bowel disease (IBD)31.78 1.87E-016.28E-01rno05202:Transcriptional misregulation in cancer71.66 1.36E-015.20E-01rno04064:NF-kappa B signaling pathway41.66 2.00E-016.52E-01rno04670:Leukocyte transendothelial migration51.65 1.80E-016.33E-01rno04010:MAPK signaling pathway111.65 8.80E-024.08E-01rno04510:Focal adhesion81.53 1.77E-016.33E-01

表 3 各組大鼠結腸組織相關趨化因子mRNA相對表達量Table 3 Relative expression of s, n=4)

注：與模型組相比，△P< 0.01。

Note. Compared with the model group,△P< 0.01.

3 討論

潰瘍性結腸炎是發(fā)生于結腸黏膜組織的非特異性腸道炎癥，其發(fā)病原因不明確。本研究應用第二代測序技術，通過比較空白組大鼠正常的結腸組織與模型組大鼠病變的結腸組織的基因表達差異，試圖找到與潰瘍性結腸炎發(fā)病機制相關的特異性基因，為中醫(yī)藥治療UC的機制研究提供一定的理論依據(jù)。通過肉眼及電子顯微鏡下觀察空白組大鼠與模型組大鼠的結腸黏膜組織，根據(jù)病理學實驗結果分析，可以初步認為模型復制成功。

對差異基因進行GO和Pathway功能富集分析結果顯示，涉及的差異表達基因多與組織的損傷密切相關，其中趨化因子信號通路與UC炎癥活動增強有直接的關系。趨化因子由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，靶細胞表達的同源性趨化因子受體與之結合后被激活，進一步對循環(huán)白細胞發(fā)出信號，使白細胞整合素對內(nèi)皮細胞粘附分子的親和力增加，促使白細胞在組織間隙中聚集[8-9]。趨化因子能夠粘附在細胞表面的糖胺聚糖上，使局部病灶的趨化劑濃度升高[10]。上皮細胞表達的趨化因子受體與趨化因子結合，具有定向遷移白細胞和淋巴細胞以及搬運造血干細胞的典型生物特征[11-12]，成為趨化因子信號通路的重要組成部分。

在本研究中脾腎陽虛型UC的大鼠組結腸織中僅發(fā)現(xiàn)了一種具有顯著差異表達的趨化因子受體CXCR2，它是否就是脾腎陽虛型UC的特異性靶點，有待進一步驗證。Buanne等[13]發(fā)現(xiàn)CXCR2基因敲除小鼠UC組織的炎癥浸潤明顯減輕，臨床癥狀亦明顯減輕，證明CXCR2在結腸炎動物模型中起著關鍵的作用。CXCR2抑制劑可以防止多形核白細胞的再循環(huán)和相關組織損傷，并進行了二期臨床試驗[14]，說明了CXCR2的高表達與組織的損傷具有明顯的相關性。研究發(fā)現(xiàn)，在CXCR2基因敲除的小鼠中CXCL1、CXCL2不能被多形核白細胞遷移[15]。CXCL1、CXCL2、CXCL6等作為CXCR2的特異性配體，在正常的人體與小鼠結腸組織中正常表達，在UC患者的黏膜中高表達[13, 16]。大量研究[17]已證實了CXCL1趨化中性粒細胞的性質(zhì)。而中性粒細胞是抵御感染的關鍵，CXCL1的表達能提高宿主防御和預防疾病的發(fā)生[18]。Shea-Donohue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1敲除小鼠的結腸炎癥表現(xiàn)更嚴重，病理組織缺少中性粒細胞浸潤。CXCL1的過度表達可能與UC的嚴重程度相關。沈守榮等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1在UC小鼠模型多種細胞趨化因子水平中顯著升高，并進一步應用CXCL1中和抗體治療UC小鼠，有效緩解了UC的進展。

Han等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL2介導大鼠腸道炎癥和損傷，通過阻斷CXCL2可減少中性粒細胞浸潤。Zahn等[23]研究表明，CXCL2可以作為檢測UC黏膜炎癥以及監(jiān)測新藥治療效果的客觀指標之一。Wuyts等[24]研究證明，CXCL6通過與CXCR2結合發(fā)揮作用，誘導白細胞趨化、促進血管新生成、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等。在UC患者腸組織中發(fā)現(xiàn)，CXCL6選擇性表達于潰瘍性的黏膜缺損區(qū)內(nèi)皮細胞中[25]。炎癥部位的單核細胞主要由CCL7調(diào)控遷移，炎癥發(fā)生時，CCL7呈現(xiàn)高表達[26-27]。在IBD患者身上，CCL7等趨化因子主要參與巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的募集[28]。Uguccioni等[29]研究證明，CCL7在正常對照組與UC組結腸組織標本中均有表達，但在UC中表達明顯上調(diào)。在慢性炎癥中，巨噬細胞分泌的CCL12表達上調(diào)，阻止修復性成纖維細胞的激活，延長炎癥反應而不利于組織愈合[30]，這一特點可能是UC病程反復發(fā)作、遷延不愈的原因之一。

綜上所述，在脾腎陽虛型UC中，以上趨化因子的表達具有一定特異性，同時也提示著疾病的發(fā)生發(fā)展過程是多種因子相互作用的結果。本研究得到了脾腎陽虛型UC差異表達的趨化因子基因序列，并應用RT-qPCR檢測差異表達的趨化因子，檢測結果與測序結果一致，說明本次測序結果可靠，進一步證明了該脾腎陽虛型UC大鼠病證結合模型具有可行性、合理性及科學性。CXCL2、CXCL1、CXCR2、CCL12、CXCL6、CCL7等因子在脾腎陽虛型UC結腸組織中表達明顯上調(diào)，且經(jīng)中西藥治療后，各治療組CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表達量均顯著下降。所以，本研究發(fā)現(xiàn)的這一系列趨化因子的差異性表達應可作為脾腎陽虛型UC的特異性靶點，并作為治療效果及預后判斷的指標。但是在脾腎陽虛型UC的發(fā)病過程中，這一系列趨化因子之間具體的相互作用及影響還不完全清楚，它們的差異表達是否完全體現(xiàn)出脾腎陽虛證的發(fā)病規(guī)律，仍有待進一步研究與驗證。