楊 勇，劉 群，章帥文，李昆太

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利用動力學(xué)模型探討甲萘醌對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響

楊 勇，劉 群，章帥文，李昆太*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

以脫氮假單胞桿菌為供試菌，通過外源添加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌，測定了維生素B12發(fā)酵過程中代謝特征參數(shù)，應(yīng)用Logistic、Luedeking-Piret 和Luedeking-Piret 修正模型建立了氧化應(yīng)激狀態(tài)下菌體生長、產(chǎn)物積累和基質(zhì)消耗的動力學(xué)方程，采用Origin9.0軟件對其進行非線性回歸分析，獲得動力學(xué)模型參數(shù)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：甲萘醌可以加快菌體生長、加速總糖消耗，但對維生素B12合成具有一定的抑制作用；擬合結(jié)果表明甲萘醌能夠有效降低菌體的最大比生長速率m、提高總糖的比消耗速率、降低維生素B12合成的比生成速率，延緩穩(wěn)定期出現(xiàn)的時間，且擬合相關(guān)系數(shù)2均達到90%，說明該模型能較好地反映本研究實驗條件下脫氮假單胞桿菌的細胞生長、產(chǎn)物合成和底物消耗過程，為接下來深入研究不同氧化應(yīng)激狀態(tài)下的菌體代謝變化特征提供參考。

脫氮假單胞桿菌；甲萘醌；維生素B12；相關(guān)系數(shù)；氧化應(yīng)激

維生素B12（Vitamin B12，VB12）系含有鈷離子的類咕啉（corrinoid）類化合物，通常被稱為鈷胺素，其分子結(jié)構(gòu)是以鈷離子為中心的咕啉環(huán)和5,6－二甲基苯并咪唑(DMBI)為堿基組成的核苷酸[1]。作為一種重要的生物活性物質(zhì)，VB12還是很多重要生物化學(xué)反應(yīng)所必需的輔酶[2]，比如分子內(nèi)重排、分子間甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)以及由三磷酸核糖核苷酸生成2′-三磷酸脫氧核糖核苷酸的還原反應(yīng)等[3]。目前，VB12主要用于治療惡性貧血癥以及末梢神經(jīng)炎[4]。由于其分子構(gòu)造高度復(fù)雜，全部的化學(xué)合成需要多達70余個反應(yīng)步驟[5]，而且成本極高，因此目前基本都是采用微生物發(fā)酵形式來生產(chǎn)合成VB12[6]。自然界中主要存在兩種不同的VB12生物合成途徑，即好氧途徑與厭氧途徑[7]，這兩種合成途徑的本質(zhì)區(qū)別在于鈷離子螯合到咕啉環(huán)的時機不同以及中心咕啉環(huán)的縮合機制不同[8]。脫氮假單胞桿菌由于具有完整的VB12合成基因，能夠在好氧條件下完成VB12的全合成，因而被廣泛應(yīng)用于VB12的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)[9]。

發(fā)酵動力學(xué)模型和方程的建立是為了解在發(fā)酵過程當(dāng)中菌體生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)消耗的動態(tài)平衡及內(nèi)在代謝規(guī)律，為后續(xù)深入研究提供理論基礎(chǔ)[10]。近年來，國內(nèi)外針對脫氮假單胞桿菌生物合成VB12發(fā)酵動力學(xué)的研究多集中在分批補料過程，如：劉東洪[11]、劉曉俠[12]等人通過建立發(fā)酵動力學(xué)模型很好地反映了VB12以及前體物質(zhì)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）分批補料發(fā)酵過程，對VB12的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的理論指導(dǎo)意義。脫氮假單胞桿菌作為典型的具有ED代謝途徑的微生物[13]，該途徑生成的NADPH，除了參與VB12合成的酶促反應(yīng)[14]，還是微生物胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，其作為電子供體參與胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)以維持胞內(nèi)正常的氧化還原平衡[15-16]，然而目前國內(nèi)外對外源氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑存在下的VB12發(fā)酵代謝研究鮮有報道。甲萘醌作為一種超氧生成劑，可以進入細胞，經(jīng)單電子還原成半醌自由基，從而進入呼吸鏈與O2作用形成·O2-[17-18]。因此，外源添加甲萘醌可以作為一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，改變菌體培養(yǎng)環(huán)境的氧化程度，起到添加活性氧的作用。

為此，本試驗以脫氮假單胞桿菌為供試菌體，在外源添加甲萘醌對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的研究基礎(chǔ)上，通過origin9.0非線性擬合，建立了菌體生長、VB12合成及基質(zhì)消耗3個動力學(xué)模型，以期為接下來深入研究脫氮假單胞桿菌在維系菌體胞內(nèi)氧化還原平衡和VB12合成中的關(guān)鍵調(diào)控作用，揭示限制性供氧促VB12高效合成的代謝機理提供試驗依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 脫氮假單胞桿菌（），由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米漿10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.0~7.2。

種子培養(yǎng)基：蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去離子水定容至1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2~7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜堿10 g，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI) 0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去離子水定容至1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2~7.4。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 材料 氫氧化鈉等常用試劑均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；蛋白胨（生化試劑），奧博星生物技術(shù)有限公司；甲萘醌，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；VB12標準品，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司；搖床、超凈工作臺，博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JW-3022高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；UV759紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；KW-1000DC HH恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠。

1.3 搖瓶發(fā)酵方法

種子液制備：每支斜面（18 mm×180 mm）以10 mL無菌水刮洗制成菌懸液。取2 mL至裝液量為50 mL/250 mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)至菌體光密度（700）為9~10。

搖瓶發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液按照10%接種量接種至裝液量為40 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中；甲萘醌溶液用0.25 μm有機相濾膜無菌過濾后按照相應(yīng)的摩爾濃度梯度（濃度梯度分別為0，0.3 μmol/L）添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 分析方法

菌體生物量[19]、VB12含量[7]、殘總糖[20]的測定按參考文獻的方法進行。

1.5 試驗數(shù)據(jù)獲得與處理

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每隔24 h取樣，分別測定菌體生物量、總糖以及VB12含量。每個實驗做3次平行實驗，取其平均值。

采用Excel2003與DPS7.05進行數(shù)據(jù)處理，origin9.0軟件進行作圖與動力學(xué)擬合分析。

1.6 動力學(xué)模型

1.6.1 菌體生長動力學(xué)模型 Logistic[21]方程是由Verhulst-Peal提出，可以直觀的顯示菌體在發(fā)酵過程當(dāng)中的生長規(guī)律，對擬合菌體的生長具有廣泛的適用性。其方程形式如下：

式中：為菌體生物量濃度；為比生長速率，h-1；表示時間，h；Xmax表示菌體生物濃度最大值。

在發(fā)酵生產(chǎn)VB12的過程中，存在著許許多多影響產(chǎn)物合成的因素，譬如：高濃度甜菜堿分解物質(zhì)的抑制作用，前體物質(zhì)甘氨酸、琥珀酰CoA和谷氨酸合成速率的影響，供氧水平與菌體形態(tài)的變化，以及菌體生長所需的營養(yǎng)成分擴散限制而導(dǎo)致菌體生長遲緩等，因此，發(fā)酵過程并不是一個均衡生長的過程。從圖1可以看出，菌體濃度呈S型增長，而Logistic模型恰好是一個非常典型的S型曲線，能夠比較準確地反映出發(fā)酵過程中菌體濃度變化對自身生長的作用，以及擬合發(fā)酵過程中菌體的生長規(guī)律。

以時間等于0，以0為起始條件，對式（1）積分可得生物量與時間的函數(shù)：

利用origin9.0軟件將（）對時間進行非線性擬合，可獲得最大比生長速率max，0和max。相關(guān)系數(shù)2可用來評價模型的擬合程度。

1.6.2 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型 從圖1可以看出，在整個發(fā)酵過程當(dāng)中，VB12合成與生長存在相關(guān)聯(lián)系。VB12作為胞內(nèi)產(chǎn)物，具備充足的菌體生物量是發(fā)酵高產(chǎn)的前提條件。根據(jù)發(fā)酵過程及試驗數(shù)據(jù)來看，VB12的合成與生物量隨時間的變化趨勢相同，當(dāng)菌體處于對數(shù)生長期，產(chǎn)物VB12同時產(chǎn)生，但只是部分合成；菌體生長停滯后，VB12繼續(xù)以某種形式大量合成。根據(jù)文獻記載，Gaden[22]將產(chǎn)物合成與菌體生長及基質(zhì)消耗相關(guān)聯(lián)，定性地將發(fā)酵過程歸為3類：生長偶聯(lián)型、非生長偶聯(lián)型和部分生長偶聯(lián)型。因此，發(fā)酵合成VB12的發(fā)酵過程為部分生長偶聯(lián)型[11]。

部分生長偶聯(lián)模型可用Leudeking-piret方程[10]表示:

式中：為產(chǎn)物濃度，μg/mL;，是經(jīng)驗常數(shù)（，均大于0），為與菌體量關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)[g/(g·h)-1]，為與菌體生長率關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)（g/g）。

把式(2)代入式(3)，并求積分得：

利用origin9.0軟件（）對進行非線性擬合，可獲得，及初始值0，相關(guān)系數(shù)2可用來評價模型擬合程度。

1.6.3 基質(zhì)消耗動力學(xué)模型 根據(jù)物料平衡法則，在VB12的發(fā)酵過程中，基質(zhì)（蔗糖）的消耗主要可分為3個部分，即：構(gòu)成菌體主要成分，維持菌體生長代謝的需要，合成產(chǎn)物VB12。因此，基質(zhì)消耗速率可以采用Luedeking-piret修正模型表示：

式中：k為細胞維持系數(shù)；Y為菌體對基質(zhì)的得率系數(shù)；為基質(zhì)濃度，μg/mL；Y為產(chǎn)物對基質(zhì)的得率系數(shù)。把式(3)代入式(5)，得：

式(1)、(3)和(6)分別構(gòu)成了發(fā)酵過程中的菌體生長、VB12合成以及總糖消耗的動力學(xué)模型，反映了發(fā)酵過程當(dāng)中菌體生長、VB12合成及總糖消耗同發(fā)酵時間之間的關(guān)系；式(2)、式(4)和式(7)分別為3個模型的積分形式，便于模型的擬合求解。將（）對進行非線性擬合，可獲得模型參數(shù)、，初始值0。相關(guān)系數(shù)2可以用來評價模型的擬合程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲萘醌對P. denitrificans發(fā)酵過程代謝變化特征影響

由圖1可知，在0~24 h期間，菌體處于適應(yīng)期，對照組與試驗組菌體量都沒有顯著增加；隨后，菌體進入對數(shù)生長期，在24~72 h期間，甲萘醌出現(xiàn)明顯抑制細胞生長的作用。甲萘醌作為一種苯醌化合物，通過氧化還原體系不斷地產(chǎn)生ROS，從而通過氧化壓力導(dǎo)致細胞損傷[23]，因此發(fā)酵初期對照組菌體量高于試驗組，可能是由于甲萘醌對于細胞生長以及相關(guān)的酶系具有抑制作用。72 h后，試驗組菌體量開始高于對照組，可能是菌體開始適應(yīng)胞外脅迫環(huán)境并利用甲萘醌。隨著發(fā)酵的進行，代謝不斷加劇，菌體生物量急劇增加，殘?zhí)羌眲∠陆担?6 h之后，菌體進入穩(wěn)定期及衰退期，殘?zhí)橇孔兓静蛔兞?。與對照組相比，添加甲萘醌加速了菌體的糖耗，側(cè)面反映了添加甲萘醌有利于菌體的生物量形成。另外，添加甲萘醌情況下，VB12產(chǎn)量也呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢。盡管該甲萘醌濃度下的菌體生物量已達到最大值，但其VB12產(chǎn)量仍比對照組降低了7.5%，僅為56.82 μg/mL。

綜上可知，添加甲萘醌可以加快菌體生長、加速總糖消耗，但是對VB12的合成具有一定的抑制作用。

□：細胞濃度（添加甲萘醌）；■：細胞濃度（不添加甲萘醌）；○：VB12添加甲萘醌；●：VB12不添加甲萘醌；△：總糖（添加甲萘醌）；▲：總糖（不添加甲萘醌）

2.2 VB12發(fā)酵動力學(xué)模型擬合求解與檢驗

將圖1中的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用于上述1.6中的各模型，采用Origin9.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得出各參數(shù)值及初始值，結(jié)果如表1所示。

表1 動力學(xué)模擬參數(shù)模擬值

將各個參數(shù)與初始值代入式（1）、式（3）和式（6），由此，我們可以得到本試驗的發(fā)酵動力學(xué)模型：

（1）菌體生長動力學(xué)模型為：

（2）VB12合成動力學(xué)模型為：

（3）基質(zhì)消耗動力學(xué)模型為：

將得到的各發(fā)酵動力學(xué)模型的擬合曲線與實際的實驗數(shù)據(jù)相比較，結(jié)果見圖2。

A1，B1，C1為對照組，A2，B2，C2為試驗組

■實驗數(shù)據(jù)（actual values）；○擬合值（simulation values）

圖2 動力學(xué)模型曲線與實驗值的比較

從圖2可以看出，所選擇的模型基本上都能較好的反映發(fā)酵合成VB12的情況。對照組菌體生長和VB12合成的擬合度2分別為0.995 6、0.994 9，試驗組二者的擬合度分別為0.990 5、0.997 5，擬合值與實驗值吻合度好，相對誤差均<1%。對照組和試驗組總糖消耗的擬合度也分別達到了0.939 2、0.925 5，擬合值與實驗值吻合度較好。此外，由圖可知，無論是否添加甲萘醌，菌體的生長曲線均為典型的S型曲線。在0—24 h，菌體處于適應(yīng)期，添加甲萘醌能明顯降低該階段菌體生長速率。隨后菌體進入對數(shù)生長期，菌體濃度顯著上升，殘?zhí)呛考眲∠陆?。菌體發(fā)酵進入穩(wěn)定期，菌體量和VB12含量峰值就出現(xiàn)在此時期。綜合圖2和實驗數(shù)據(jù)可以看出，甲萘醌的添加能夠有效降低菌體的最大比生長速率m、提高總糖的比消耗速率、降低VB12合成的比生成速率，延緩穩(wěn)定期出現(xiàn)的時間。

3 結(jié)論與討論

發(fā)酵過程的理論與方法已被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)微生物產(chǎn)品生產(chǎn)及工藝優(yōu)化，使得現(xiàn)代工業(yè)微生物發(fā)酵取得了高速發(fā)展[24]。Kang等[5]通過一系列發(fā)酵工藝的優(yōu)化，使的VB12工業(yè)化發(fā)酵水平近年來得到了大幅度的提高，穩(wěn)定在200 mg/L以上。但作為具有VB12好氧合成途徑的菌株，是否會與嗜糖假單胞菌（）[25]、惡臭假單胞菌（）[26]等大多假單胞菌類一樣，對胞內(nèi)氧化環(huán)境較為敏感。為此，本文首先通過外源添加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌，利用進行搖瓶發(fā)酵實驗，測定了VB12合成過程中的菌體量、VB12和殘?zhí)呛康却x特征參數(shù)。根據(jù)結(jié)果顯示，甲萘醌可以促進菌體生長、加速總糖消耗，但是對VB12合成具有一定的抑制作用。結(jié)合文獻報道[27]，可以分析得出，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌的加入雖然能延緩菌體穩(wěn)定期出現(xiàn)的時間，顯著增強NADP磷酸酶的酶活，增加胞內(nèi)NADPH的供給，但同樣誘發(fā)了胞內(nèi)氧化環(huán)境的加劇，迫使菌體不得不將更多的NADPH用于抗氧化應(yīng)激并維持胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而使得流向VB12合成途徑的NADPH偏少，從而最終影響VB12的合成量。

發(fā)酵動力學(xué)模型是研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動之間的相互作用隨時間變化規(guī)律的手段, 目的在于按照人們的需求來控制發(fā)酵過程[28]，對發(fā)酵工藝的分析、優(yōu)化、放大和控制具有非常重要的指導(dǎo)意義[29]。劉東洪等[11]以為供試菌株, 對VB12分批補料發(fā)酵動力學(xué)模型進行研究，建立了該菌株發(fā)酵合成VB12的菌體生長、產(chǎn)物合成和總糖消耗的動力學(xué)模型，較好地反映了VB12分批補料的發(fā)酵過程；Li等[30]通過研究發(fā)現(xiàn)，相比較于發(fā)酵過程中較高的DO控制濃度，限制性DO調(diào)控策略反而更有利于中的VB12合成?；诰w在不同DO水平下的代謝調(diào)節(jié)機制，本文對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌狀態(tài)下的菌體發(fā)酵產(chǎn)VB12動力學(xué)變化進行了研究，通過建立發(fā)酵動力學(xué)模型，可以實時監(jiān)控發(fā)酵過程中菌體生長、代謝產(chǎn)物合成、基質(zhì)消耗的變化規(guī)律。模型擬合結(jié)果表明，對照組菌體生長、VB12合成以及總糖消耗的擬合度2分別為0.995 6、0.994 9、0.939 2，試驗組三者的擬合度分別為0.990 5、0.997 5、0.925 5，擬合值與實驗值相近，模型能較好地反映發(fā)酵過程規(guī)律。

本文通過外源添加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌，測定了VB12發(fā)酵過程中代謝特征參數(shù)，建立了氧化應(yīng)激狀態(tài)下菌體發(fā)酵動力學(xué)模型，對深入探究在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的代謝輔因子變化規(guī)律，明確其在維系菌體胞內(nèi)氧化還原平衡和VB12合成中的關(guān)鍵調(diào)控作用，揭示限制性供氧促VB12高效合成的代謝機理具有重要指導(dǎo)意義。

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Study on Effects of Menadione onFermentation by Kinetics Model

YANG Yong, LIU Qun, ZHANG Shuai-wen, LI Kun-tai*

(College of Biological Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In this paper, usingas the producing strain, the metabolic parameters of vitamin B12fermentation were studied by adding the exogenous oxidative stress inducer menadione. And the kinetic equations of biomass growth, production formation and substrate consumptionwere established by applying the Logistic, the Luedeking-Piret and the modified Luedeking-Piret equations. The non-linear curves were fitted and the kinetic parameters were calculated with Origin9.0. The results showed that menadione could promote the growth of bacteria and accelerate the substrate consumption, but significantly inhibited the synthesis of vitamin B12. By fitting, it was found that menadione could effectively reduce the maximum specific growth rate of bacteria, increase the specific consumption rate of total sugar, reduce the specific production rate of vitamin synthesis, and delay the emergence time of stable phase. And all the fitting correlation coefficients2were up to 90%, which showed the model could well reflect the cell growth, product synthesis and substrate consumption of. This study provided a reference for the further study of metabolic characteristics of bacteria under different oxidative stress condition.

; menadione; vitamin B12; correlation coefficient; oxidative stress

Q924

A

2095-3704（2018）03-0184-08

2018-06-19

國家自然科學(xué)基金項目（209005220）、江西?。ㄇ嗄辏┳匀豢茖W(xué)基金重大項目（20143ACB2100）和江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計劃項目（20142BCB23025）

楊勇（1993—），男，碩士生，主要從事微生物代謝調(diào)控方面的研究，wy931221@sina.com；

李昆太，教授，博士，atai78@sina.com。

楊勇, 劉群, 章帥文, 等. 利用動力學(xué)模型探討甲萘醌對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(3): 184-191.