韓正洲，吳正軍，魏偉鋒，陳新連，林余霖，王瑀*

（1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所國家中醫(yī)藥管理局中藥資源保護(hù)重點研究室，北京 100193；3.國家中成藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 本溪 117004）

蘆根為禾本科植物蘆葦Phragmites communis Trin.[《Flora of China》收錄本種為Phragmites australis（Cav.）Trin.ex Steud.]的新鮮或干燥根莖，全年均可采挖，除去芽、須根及膜狀葉后入藥[1]。蘆根為臨床常用中藥，全國各地均產(chǎn)[2]，具有清熱瀉火、生津止渴、除煩、止嘔、利尿的功效，用于熱病煩渴、肺熱咳嗽、肺癰吐膿、胃熱嘔噦、熱淋澀痛[1]。蘆根最主要的化學(xué)成分為多糖，其次為黃酮、甾體、蒽醌、生物堿等多種成分，臨床研究發(fā)現(xiàn)蘆根主要具有保肝、抗菌等功效，對感冒、支氣管炎、口臭、急性扁桃體炎、肺膿瘍等疾病具有良好的治療效果[3]。臨床應(yīng)用中，蘆根藥材混偽品主要為同科的蘆竹Arundo donax Linnaeus、芒Miscanthus sinensis Anderss.、菰 Zizania latifolia（Griseb.）Stapf等的根莖，蘆竹的根莖具有清熱瀉火、生津止渴、除煩、利尿消腫等功效，主治熱病煩渴、骨蒸發(fā)熱、吐血、熱淋、小便不利、風(fēng)火牙痛等癥[4]，《民間常用草藥匯編》記載芒的根莖能通氣血，治婦女干病[5]；菰的根莖有清熱解毒、除煩止渴的功效，主治消渴、心煩、小便不利、小兒麻疹高熱不退、燒燙傷等[6]，在廣東地區(qū)用量較大，并常與蘆根互相替補(bǔ)使用或混淆使用[7]。因蘆根和蘆竹根均有清熱瀉火、生津止渴的功效，加之藥材性狀相似，臨床應(yīng)用常出現(xiàn)混淆和誤用[8]。另外，蘆葦、蘆竹和芒的生長習(xí)性相似，喜河岸、池塘、沼澤及濕潤地生長，并且植物形態(tài)非常相似，導(dǎo)致蘆根藥材采收時，出現(xiàn)植物辨認(rèn)不清、藥材來源混亂等情況[9]。

DNA條形碼自2003年[10]被提出后就受到國際廣泛關(guān)注。DNA條形碼鑒定是利用基因組中一段公認(rèn)相對較短的序列對物種進(jìn)行識別鑒定，可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別的局限。該技術(shù)物種鑒定效率高、方法簡單，不受外界環(huán)境、樣品形態(tài)和材料部位的限制，能夠滿足不同行業(yè)及不同科研背景工作者對中藥材鑒定的要求，為中藥材流通領(lǐng)域及食品藥品相關(guān)行業(yè)的監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的工具[11-12]。Chen等在大量實驗研究基礎(chǔ)上建立了以ITS2為主、psbA-trnH為輔的植物類藥材鑒定系統(tǒng)[13]。蘆根的混偽情況會影響蘆根的品質(zhì)和臨床用藥安全，需要一種快速、準(zhǔn)確的鑒定方法對該藥材的鑒定提供支持。目前，已有研究從形態(tài)、性狀、生藥學(xué)特征等方面對蘆根及其混偽品進(jìn)行區(qū)分[7，9，14]，本研究運用psbA-trnH序列對蘆根及其混偽品進(jìn)行鑒定，旨在為該藥材的市場監(jiān)管、用藥安全和臨床療效等方面提供參考。

1 材料

研究材料包括4個物種40份樣品，其中蘆根及其基原植物樣品共18份，分別來源于安徽亳州藥市、河北安國藥市等，樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，均為禾本科植物蘆葦P.communis的根。從GenBank下載的蘆葦序列4條，混偽品序列18條，具體樣品信息詳見表1。

表1 蘆根及其混偽品樣品信息表

續(xù)表1

2 方法

2.1 DNA提取

按照中藥材DNA條形碼分子鑒定法標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）提取蘆根及其基原植物的DNA[15]，蘆根干燥樣品取樣量為40 mg，基原植物干燥葉片為20 mg，藥材樣品研磨后用核分離液 [100 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），0.7 mmol·L－1NaCl，2%PVP 40，0.4% β-巰基乙醇]洗滌3次，用植物DNA提取試劑盒（Bioteke Co.，China）提取DNA，按操作說明進(jìn)行。藥材類樣品65℃水浴90 min，葉片類樣品65℃水浴30 min。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

參照Chen等[16]的研究方法，對psbA-trnH序列進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物 TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72℃7 min。PCR反應(yīng)體積為25μL，包括12.5μL 2×Taq Master Mix（北京艾德萊生物科技有限公司，北京），正反向引物各取1μL，DNA模板2μL，用8.5μL ddH2O補(bǔ)足體積至25μL[15]。設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為陰性對照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院開放實驗室進(jìn)行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

測序得到的峰圖利用CodonCode Aligner V 5.1.5進(jìn)行比對和拼接，去除引物區(qū)，獲得嚴(yán)格一致性序列，然后將所有序列用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）進(jìn)行分析比對，并基于Kimura-2-parameter（K2P）雙參數(shù)模型計算遺傳距離，用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆根psbA-trnH序列特征

蘆根不同來源樣品序列共有22條，序列長度為482～483 bp，G＋C含量為37.7%～37.8%，種內(nèi)變異位點 2個，第 66、67位點均為 C-G變異，第418位點為插入／缺失，有 2種單倍型，Y17045MT02為1種單倍型，其余21條序列為1種單倍型。主導(dǎo)單倍型序列見圖1，蘆根psbA-trnH序列峰圖特征如圖2所示。

圖1 蘆根psbA-trnH主導(dǎo)單倍型序列

圖2 蘆根psbA-trnH主導(dǎo)單倍型序列峰圖

3.2 蘆根與其混偽品psbA-trnH序列種間變異分析

將蘆根與其各混偽品的psbA-trnH序列的單倍型進(jìn)行比對，共有26個變異位點，詳見圖3。

將所有40條psbA-trnH序列進(jìn)行比對，計算得出蘆根psbA-trnH序列種內(nèi)K2P距離為0～0.004 2，蘆根與其混偽品的種間最小K2P距離0.008 3，大于蘆根種內(nèi)最大K2P距離，見表2，因此psbA-trnH序列可以將蘆根及其混偽品區(qū)分開。

圖3 蘆根及其混偽品的psbA-trnH序列種間變異位點

表2 蘆根及其混偽品psbA-trnH序列種內(nèi)種間K2P距離

3.3 蘆根及其混偽品的psbA-trnH序列聚類分析

蘆根P.communis有2種單倍型，這2種單倍型序列各選1條，蘆竹Arundo donax只有1個單倍型，選擇1條序列，菰Zizania latifolia和芒Miscanthus sinensis也各有2種單倍型，使用全部序列，基于psbA-trnH序列用MEGA 6.0構(gòu)建蘆根及其混偽品NJ系統(tǒng)聚類樹（見圖4），從NJ樹中可以看出，蘆根樣品單獨聚為一支，支持率為99%，其混偽品各自聚為一支。

圖4 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的蘆根及其混偽品的NJ樹

4 討論

4.1 蘆根樣品的DNA提取

成功提取藥材基因組DNA是中藥材DNA條形碼鑒定技術(shù)的前提和基礎(chǔ)。蘆根樣品為植物的根莖，含多糖、多酚類成分，研磨時多酚極易氧化成醌類[11]，使DNA帶有一定顏色，在純化過程中很難去除，影響后續(xù)的PCR反應(yīng)。因此，為了提高蘆根樣品的DNA提取效率，本研究對試劑盒法進(jìn)行以下改良：提取藥材DNA時加大樣品量；加大聚乙烯吡咯烷酮的使用量；用核分離液洗滌多次；降低水浴溫度，適當(dāng)延長水浴時間，在56℃水浴放置8～12 h，使得細(xì)胞充分裂解，DNA充分釋放到緩沖溶液中。蘆根藥材和基原植物樣品采用改良后的DNA提取試劑盒法均成功得到其基因組DNA。

4.2 應(yīng)用psbA-trnH條形碼序列對蘆根及其混偽品的鑒定

蘆根混偽品與蘆根形態(tài)相似，傳統(tǒng)鑒別比較依賴專業(yè)人員，混用誤用嚴(yán)重影響蘆根的質(zhì)量安全和臨床療效。本研究從各地及GenBank上最終得到蘆根及其混偽品序列共40條，運用植物試劑盒成功提取藥材和基原植物的DNA，因使用ITS2序列通用引物擴(kuò)增困難，本研究使用psbA-trnH序列通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，蘆根種內(nèi)較為保守，僅2個變異位點。蘆根與其混偽品psbA-trnH序列變異位點為26個，種間K2P距離為0.008 3～0.036 1，種間最小遺傳距離大于蘆根種內(nèi)最大遺傳距離。NJ樹顯示蘆根樣品聚為一支，支持率為99%，其混偽品也各自聚為一支，可以明顯鑒別開蘆根及其混偽品。由此可見，psbA-trnH序列可準(zhǔn)確鑒定蘆根及其混偽品，有利于保障蘆根的質(zhì)量安全和臨床療效，并為保證藥材在市場上的安全流通和質(zhì)量監(jiān)管提供參考。