孫強(qiáng)，劉斌，杜海云

（泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000）

養(yǎng)肝解毒丸是由龍膽草、夏枯草、熟地黃、五味子、山茱萸、牡丹皮等十二味中藥組成的復(fù)方制劑，有滋腎、解毒之功效，用于慢性肝炎，轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)不降者。龍膽草其有效成分龍膽苦苷對(duì)肝臟化學(xué)損傷和免疫損傷有保護(hù)作用[1-2]；夏枯草具有清肝瀉火、明目的作用，迷迭香酸作為其指標(biāo)性成分[3-4]；五味子具有滋補(bǔ)、強(qiáng)身、安神的作用，五味子醇甲為其指標(biāo)性成分[5]；山茱萸具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗菌、抗炎等作用[6-7]，馬錢(qián)苷為其指標(biāo)性成分；牡丹皮主要活性成分丹皮酚具有保護(hù)肝腎、抗炎、解熱等多種藥理作用[8-9]。本研究以龍膽草中的龍膽苦苷、夏枯草中的迷迭香酸、五味子中的五味子醇甲、山茱萸中的馬錢(qián)苷、牡丹皮中的丹皮酚為定量指標(biāo)，同時(shí)對(duì)養(yǎng)肝解毒丸中的多種成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)5種成分紫外吸收特征的不同，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢查法，在3個(gè)紫外波長(zhǎng)下，同時(shí)測(cè)定5種活性成分的含量。結(jié)果表明，本法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，分離效果好，可為養(yǎng)肝解毒丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司），LC solution工作站；十萬(wàn)分之一電子天平（Mettler Toledo XS205DU）

1.2 試藥

龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-201314）、五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-201412）、馬錢(qián)苷對(duì)照品（批號(hào)：111640-201005）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201005）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：111871-201505），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；養(yǎng)肝解毒丸（魯藥制字Z09080126，批號(hào)：171026、171109、180101）；甲醇為色譜純，磷酸等均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Hss C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.5%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫（0～10 min，30%A；10～20 min，30%～40%A；20～30 min，40% ～80%A；30～40 min，80%～30%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：馬錢(qián)苷、五味子醇甲240 nm，龍膽苦苷、丹皮酚275 nm，迷迭香酸330 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照品適量，分別加80%甲醇制成質(zhì)量濃度為560、456、203、682、218μg·mL－1的對(duì)照品貯備液。再分別精密量取貯備液適量，加80%甲醇制成含龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲分別為56.0、45.6、20.3、68.2、21.8μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品，研細(xì)，精密稱(chēng)定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醚30 mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 KHz）15 min，放冷，過(guò)濾，取濾渣晾干后備用。將濾渣至于錐形瓶中精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 KHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照樣品溶液 按制劑制備方法，分別制備不含龍膽草、山茱萸、夏枯草、牡丹皮、五味子的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 空白試驗(yàn)

按上述色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照樣品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：陰性對(duì)照樣品溶液在與龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。HPLC圖見(jiàn)圖1～7。

圖1 養(yǎng)肝解毒丸對(duì)照品HPLC圖

圖2 養(yǎng)肝解毒丸樣品HPLC圖

圖3 缺龍膽草陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖4 缺山茱萸陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖5 缺夏枯草陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖6 缺牡丹皮陰性對(duì)照樣品HPLC圖

圖7 缺五味子陰性對(duì)照樣品HPLC圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲儲(chǔ)備液各0.1、0.5、1、2.5、5 mL分別置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，記錄色譜圖，量取峰面積。以峰面積 Y對(duì)濃度X（μg·mL－1）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的回歸方程分別為：Y＝1.034×104X＋1.120×103（r＝0.999 6）、Y＝3.005×104X－1.703×103（r＝0.999 8）、Y＝3.604×104X＋2.322×103（r＝0.999 3）、Y＝7.876×104X＋1.024×103（r＝0.999 5）、Y＝5.107×104X－1.084×103（r＝0.999 7），龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的線(xiàn)性范圍分別為 5.60～280、4.56～228、2.03～101.5、6.82～341、2.18～109μg·mL－1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積考察精密度，龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲面積的RSD分別為0.3%、0.6%、0.5%、0.4%、0.6%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.2.2項(xiàng)下，平行制備同一樣品（批號(hào)：180101）6份，依上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定，并分別計(jì)算含量，龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的含量平均值分別為1.08、0.87、0.37、1.24、0.38 mg·g－1，RSD分別為 0.7%、0.9%、0.6%、0.5%、0.8%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品，按照2.2.2項(xiàng)下方法處理，依上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進(jìn)行測(cè)定，龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲面積的RSD分別為0.4%、0.5%、0.6%、0.3%、0.6%。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品1.0 g，共6份，分別精密加入龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲對(duì)照品貯備液2.0 mL，照2.2.2項(xiàng)下方法制成加樣回收供試液，依上述色譜條件依法進(jìn)行測(cè)定，并分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9 樣品測(cè)定

取本品3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中龍膽苦苷、馬錢(qián)苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

養(yǎng)肝解毒丸由十二味中藥組成，為了能同時(shí)檢測(cè)5種活性成分，采用二極管陣列檢測(cè)器，多波長(zhǎng)檢測(cè)各成分的含量。龍膽苦苷在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，靈敏度高，無(wú)干擾峰，丹皮酚在202、275、314 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇275 nm作為它們共同的測(cè)定波長(zhǎng)；馬錢(qián)苷在240 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，五味子醇甲在240～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有很大吸收，在此波長(zhǎng)下馬錢(qián)苷、五味子醇甲吸收值高，分離度好，因此選擇240 nm為兩者的測(cè)定波長(zhǎng)；迷迭香酸在203、280、330 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，從圖2看出在330 nm處?kù)`敏度高，無(wú)干擾峰，故選擇此波長(zhǎng)檢測(cè)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，試驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3種流動(dòng)相分別進(jìn)行試驗(yàn)考察，結(jié)果以甲醇-0.5%磷酸為流動(dòng)相，峰型更尖銳，分離度更好，理論塔板數(shù)更高。同時(shí)為了使所測(cè)物質(zhì)的色譜峰分離度更好，出峰時(shí)間更合理，采用梯度洗脫的方法。通過(guò)對(duì)甲醇和0.5%磷酸溶液的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)和優(yōu)化，使得所測(cè)5種活性成分均峰形良好，保留時(shí)間適宜，不受雜質(zhì)峰的影響，見(jiàn)圖2。

3.3 供試品溶液制備方法的考察

首先先用甲醇對(duì)藥材進(jìn)行了提取，發(fā)現(xiàn)色譜峰雜質(zhì)比較多，故用乙醚對(duì)極性小的成分進(jìn)行提取，

分離。提取后的藥渣再以甲醇、80%甲醇溶液和50%甲醇溶液為溶劑，分別采取超聲 15、30、45 min提取方法處理樣品，比較發(fā)現(xiàn)5種成分在80%甲醇溶液中均較穩(wěn)定，提取效果好，雜質(zhì)干擾少。而采用80%甲醇溶液超聲15 min已經(jīng)將樣品中的5種活性成分提取完全，且節(jié)約時(shí)間，操作簡(jiǎn)便。使用本法測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，基線(xiàn)平穩(wěn)，可有效地控制養(yǎng)肝解毒丸的質(zhì)量。