洪翠麗，金振輝，朱亮亮，潘林鑫，耿慧武，劉曉穎

氯離子通道蛋白1(chloride intracellular channel 1,CLIC1)是氯離子通道家族中的一員。CLIC家族中對CLIC1的研究較多，其可以插入膜并形成氯離子通道。CLIC1的膜結(jié)合形式中N末端是細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)，C末端在膜內(nèi)側(cè)[1-2]。CLIC1的C末端與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GST)具有很高的同源性[3-4]；N末端是高度保守區(qū)域，含有硫氧還原蛋白區(qū)域，可折疊成谷氧還原蛋白，其中CLIC1中的Trp35(色氨酸殘基)被認(rèn)為是CLIC1蛋白的跨膜結(jié)合位點(diǎn)[5-6]。以往的研究[7-8]表明CLIC1與神經(jīng)性疾病、惡性腫瘤增殖相關(guān)。 據(jù)報(bào)道CLIC1的第49～51位3個(gè)氨基酸是跨膜結(jié)構(gòu)域中最重要的序列[9]。在本課題組前期已經(jīng)證實(shí)了CLIC1與Sedlin(是SEDL基因的表達(dá)產(chǎn)物)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在相互作用[10]的基礎(chǔ)上，構(gòu)建第49～51位氨基酸的缺失突變體重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG，進(jìn)一步研究CLIC1(Δ49-51)與Sedlin在HEK 293T細(xì)胞中是否存在相互作用，探究這3個(gè)氨基酸的缺失對其與Sedlin相互作用的影響，為進(jìn)一步揭示CLIC1在腫瘤中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、質(zhì)粒和菌株 載體pcDNA3.1、pGEX-5X-3，菌株TG1、BL21、DH5α等，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG均為本實(shí)驗(yàn)室保存。COS7細(xì)胞、HEK 293T細(xì)胞等也為本實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞。

1.1.2主要試劑 PrimeSTAR 酶購自日本TaKaRa公司；BamH I、Xho I、EcoR I等限制性內(nèi)切酶；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；蛋白Marker購自美國Thermo公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2 000、Opti-MEM購自美國Invitrogen公司；FLAG抗體購自美國Sigma公司；熒光封片膠購自丹麥DAKO公司；PVDF膜購自加拿大BioBasic公司；SuperSignal West Pico 顯色試劑盒購自美國Pierce公司；激光共聚焦顯微鏡由安徽醫(yī)科大學(xué)大型儀器共享平臺提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用DMEM高糖培養(yǎng)基(其中含5%的胎牛血清和100 U/ml的青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)COS7細(xì)胞和HEK 293T細(xì)胞，其中培養(yǎng)箱為37 ℃、5% CO2；當(dāng)細(xì)胞長滿單層時(shí)傳代，PBS洗2次，胰酶消化至細(xì)胞變圓時(shí)，DMEM終止消化；離心后用PBS緩沖液重懸細(xì)胞清洗，并以適當(dāng)密度接種到培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)；次日，將質(zhì)粒(μg) ∶脂質(zhì)體(μl)按1 ∶2.5的比例轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。而免疫熒光實(shí)驗(yàn)按1 ∶1.5[質(zhì)粒(μg) ∶脂質(zhì)體(μl)]的比例轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4～6 h換新鮮的培養(yǎng)液(不含雙抗)。

1.2.2免疫熒光爬片 轉(zhuǎn)染24 h后取出培養(yǎng)皿，用放置在4 ℃冰箱的PBS緩沖液洗3次；-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定2 min，70%的乙醇固定5 min；1%脫脂奶粉(用TBST配制)封閉30 min；先用FLAG抗體孵育2 h，隨后山羊抗小鼠IgG(TRITC標(biāo)記的)孵育1 h；DAPI染核3 min后，PBS洗3次，每次5 min；熒光封片膠DAKO封片；次日觀察并拍攝激光共聚焦照片。

1.2.3GST pulldown實(shí)驗(yàn) 同上述轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染48 h后收細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS小心洗1次，棄去PBS，然后在培養(yǎng)皿中加入適量胰酶，胰酶消化1 min左右(顯微鏡下觀察到細(xì)胞從壁上脫落下來)，低速離心(1 500 r/min 、2 min)收集細(xì)胞于1.5 ml EP管中，加入適量細(xì)胞裂解液(按細(xì)胞量的多少具體情況而定)，4 ℃ 層析柜混旋儀上混懸40 min(收細(xì)胞的前1 d下午用預(yù)溫的PBS清洗GST珠子3次，分別加入GST和GST-Sedlin融合蛋白混旋儀上過夜混懸)，把裂解好的細(xì)胞裂解液取出40 μl加入10 μl的5×SDS混合，煮沸，冰浴，放于-20 ℃ 冰箱待電泳。把剩下的細(xì)胞裂解液分別加入到上述過夜混懸好的GST和GST-Sedlin融合蛋白(過夜混懸好結(jié)合緩沖液洗3次)里，再次混懸4 h?；鞈医Y(jié)束后(結(jié)合緩沖液再次洗3次)加入等量的2×SDS，煮沸7 min,冰上5 min，下一步Western blot分析。

1.2.4免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 同上述轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染48 h后收細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS小心洗1次，棄去PBS，然后在培養(yǎng)皿中加入適量胰酶，胰酶消化1 min左右(顯微鏡下觀察到細(xì)胞從壁上脫落下來)，低速離心(1 500 r/min、2 min)收集細(xì)胞于1.5 ml EP管中，加入適量細(xì)胞裂解液(按細(xì)胞量的多少具體情況而定)，4 ℃ 層析柜混旋儀上混懸40 min，把裂解好的細(xì)胞裂解液分別取出40 μl加入10 μl的5×SDS混合，煮沸，冰浴，放于-20 ℃冰箱待電泳。把剩下的細(xì)胞裂解液分別加入適量的FLAG抗體再次混懸4 h，混懸結(jié)束后把混懸好的混合液加入到事先清洗好的瓊脂糖珠子里(混懸快結(jié)束時(shí)用預(yù)溫的PBS清洗瓊脂糖珠子3次)，再次混懸4 h，混懸結(jié)束后用IP清洗液再次洗結(jié)合珠子3次(4 ℃、3 000 r/min,3 min)棄上清液，加入等量的2×SDS，煮沸7 min,冰上5 min，下一步Westen blot分析。

1.2.5Westen blot分析 配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳先30 min 70 V后80 min 100 V。三明治裝置濕轉(zhuǎn)100 V、75 min。取出PVDF膜，封閉液(TBST+5%脫脂奶粉配制)封閉2 h，F(xiàn)LAG鼠抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，F(xiàn)LAG二抗(1 ∶5 000)孵育1.5 h，顯影。

1.2.6核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后收細(xì)胞，胰酶消化2 min，將細(xì)胞收集到離心管中并加入5倍體積的CE buffer，同時(shí)冰上裂解6 min,間歇震蕩裂解液。4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，收集上清液。加入相等量的2×SDS上樣緩沖液于上清液中，沸水浴7 min，冰上冷卻后，-20 ℃存放備用。用適量的CE buffer(不含NP-40)洗滌沉淀，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，用同樣的方法洗滌2～3次以確保除盡沉淀中的胞質(zhì)蛋白。加入與之相等體積的NE buffer于剩余的沉淀中，冰上裂解11 min，間歇震蕩裂解液。4 ℃、14 000 r/min 離心6 min，收集上清液，加入適量5×SDS上樣緩沖液，沸水浴7 min，冷卻后，-20 ℃存放備用。

2 結(jié)果

2.1CLIC1缺失突變體的構(gòu)建對質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG進(jìn)行雙酶切(BamH I, Xho I),見圖1。CLIC1缺失突變體被切成2條強(qiáng)帶，與Marker對比，一條帶大約在5 148 bp位置上，另一條位置不超過831 bp，相應(yīng)的質(zhì)粒送往通用生物有限公司進(jìn)行測序，反饋的結(jié)果指示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖和測序圖

M:DNA Marker；1:pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的酶切鑒定結(jié)果；2:pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的酶切鑒定結(jié)果和測序圖

2.2CLIC1及其缺失突變體CLIC1(Δ49-51)蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的HEK 293T細(xì)胞裂解液分別能檢測到相應(yīng)的條帶。與預(yù)染蛋白Marker相比較其符合CLIC1蛋白和CLIC1(Δ49-51)蛋白的大小。CLIC1蛋白大小為27 ku，CLIC1(Δ49-51)蛋白的分子量略低于27 ku。見圖2。

圖2 Western blot檢測 CLIC1(Δ49-51)和CLIC1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

1：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG的細(xì)胞裂解液；2：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細(xì)胞裂解液

2.3CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7細(xì)胞中的定位以及其與Sedlin蛋白的共定位CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有明顯的表達(dá)，且在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)量明顯多于細(xì)胞核，見圖3A。圖3B示CLIC1和Sedlin的共定位。CLIC1(Δ49-51)蛋白與Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均不存在共定位現(xiàn)象，見圖3C。

2.4CLIC1(Δ49-51)與Sedlin蛋白在體外不存在相互作用分別對CLIC1、CLIC1(Δ49-51)蛋白與Sedlin蛋白進(jìn)行了GST pulldown實(shí)驗(yàn)，即對照組[GST+CLIC1-FLAG/GST+CLIC1(Δ49-51)-FLAG]和實(shí)驗(yàn)組[GST-Sedlin+CLIC1-FLAG/GST-Sedlin+CLIC1(Δ49-51)-FLAG]，收集谷胱甘肽珠子進(jìn)行Western blot分析，見圖4A、4B。進(jìn)行免疫印跡(用FLAG抗體)后，A中1泳道細(xì)胞裂解液組和3泳道實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了明顯條帶，而B中3泳道實(shí)驗(yàn)組和2泳道對照組均未出現(xiàn)任何條帶。并且1、3泳道的條帶位置基本一致，與預(yù)染蛋白Marker 27 ku的條帶橫向比對后，其大小分別與CLIC1(27 ku)和CLIC1(Δ49-51)(27 ku)的大小相符。同時(shí)，又對A、B中的1、2、3的樣品進(jìn)行GST抗體免疫印跡后，見圖4A、4B，對照組(2泳道)和實(shí)驗(yàn)組(3泳道)分別約在Marker的20～30 ku和30～45 ku之間的位置存在很強(qiáng)的蛋白條帶，大小分別與GST(26 ku)和GST-Sedlin(42 ku)融合蛋白的大小相符。綜上表明，CLIC1蛋白與Sedlin蛋白在體外存在相互作用，而CLIC1(Δ49-51)蛋白與Sedlin蛋白在體外不存在相互作用。

2.5CLIC1(Δ49-51)與Sedlin蛋白不存在相互作用在上述GST pulldown體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了相應(yīng)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)：CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP(對照組)，CLIC1-FLAG+GFP -Sedlin/CLIC1(Δ49-51) -FLAG+GFP-Sedlin(實(shí)驗(yàn)組)，見圖5A、5B。進(jìn)行免疫印跡(用FLAG抗體)后，對照組1、2泳道和實(shí)驗(yàn)組3、4泳道均出現(xiàn)了明顯的條帶，與預(yù)染Marker比對，目的條帶在25～35 ku之間，1～4號泳道條帶的大小與CLIC1及CLIC1(Δ49-51)(27 ku)的蛋白大小相符。免疫印跡(用GFP抗體)后，對照組1、2泳道和A中實(shí)驗(yàn)組4泳道均出現(xiàn)了明顯條帶，與預(yù)染Marker橫向比對，各目的條帶的分子量大小正確，而對照組3泳道和B中實(shí)驗(yàn)組4泳道未出現(xiàn)任何條帶。該結(jié)果顯示，在HEK 293T細(xì)胞中，CLIC1蛋白與Sedlin蛋白存在相互作用，而CLIC1(Δ49-51)蛋白與Sedlin蛋白不存在相互作用。

圖3 CLIC1(Δ49-51)在COS7細(xì)胞中的定位及其與Sedlin蛋白的共定位

TRITC：FLAG標(biāo)簽蛋白；DAPI：示細(xì)胞核；GFP：GFP標(biāo)簽蛋白；MERGE：疊加效果；A：CLIC1(Δ49-51)蛋白在COS7細(xì)胞中的定位；B: CLIC1與Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位； C： CLIC1(Δ49-51)與Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位

圖4 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)與Sedlin蛋白的GST pulldown實(shí)驗(yàn)

1：單轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG/CLIC1(Δ49-51)-FLAG的細(xì)胞裂解液； 2：谷胱甘肽珠子下拉GST+CLIC1-FLAG/GST+CLIC1(Δ49-51)-FLAG混合液； 3：谷胱甘肽珠子下拉GST-Sedlin+CLIC1/GST-Sedlin+CLIC1(Δ49-51)-FLAG混合液

圖5 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)與Sedlin蛋白的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

1：共轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP的細(xì)胞裂解液； 2：共轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG+Sedlin-GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+Sedlin-GFP的細(xì)胞裂解液； 3：用FLAG抗體免疫沉淀共轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG+GFP/CLIC1(Δ49-51)-FLAG+GFP的細(xì)胞裂解液； 4：用FLAG抗體免疫沉淀共轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG+GFP-Sedlin/CLIC1(Δ49-51)+Sedlin-GFP的細(xì)胞裂解液

2.6CLIC1(Δ49-51)蛋白與CLIC1蛋白在COS7細(xì)胞中表達(dá)存在差異在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了CLIC1、CLIC1(Δ49-51)的核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)，見圖6，進(jìn)行免疫印跡(FLAG抗體)后，1～4泳道均出現(xiàn)了明顯的條帶，與預(yù)染Marker比對，目的條帶在25～35ku之間，1～4號泳道條帶的大小與CLIC1及CLIC1(Δ49-51)(27ku)的蛋白大小相符。以Lamin抗體免疫印跡后，2泳道和4泳道均出現(xiàn)了明顯條帶，橫向比對預(yù)染Marker，各目的條帶的分子量大小正確。以Tubulin抗體免疫印跡后，1泳道和3泳道均出現(xiàn)了明顯條帶，橫向比對預(yù)染Marker，各目的條帶的分子量大小正確。該結(jié)果顯示，在COS7細(xì)胞中，CLIC1缺失第49～51位氨基酸后，其在細(xì)胞中的定位也發(fā)生明顯改變，即CLIC1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，表達(dá)量基本無差別，而CLIC1(Δ49-51)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞中也均有表達(dá)，但細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量明顯高于細(xì)胞核。

圖6 CLIC1、CLIC1(Δ49-51)的核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)

1：單轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG分離的CLIC1細(xì)胞質(zhì)的裂解液；2：單轉(zhuǎn)CLIC1-FLAG分離的CLIC1細(xì)胞核的裂解液；3：單轉(zhuǎn)CLIC1(Δ49-51)-FLAG分離的CLIC1(Δ49-51)細(xì)胞質(zhì)的裂解液；4：單轉(zhuǎn)CLIC1(Δ49-51)-FLAG分離的CLIC1(Δ49-51)細(xì)胞核的裂解液

3 討論

CLIC1是真核細(xì)胞的重要陰離子通道。研究[9]表明，保守的陽離子基團(tuán)能增強(qiáng)CLIC1的膜結(jié)合能力。把CLIC1跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基第49位的賴氨酸、50位的精氨酸、51位的精氨酸分別用3個(gè)連續(xù)帶負(fù)電荷的谷氨酸代替后，即剔除KRR基序能夠阻礙膜結(jié)合，中斷靜電相互作用。相反，帶正電荷的KRR基序能夠形成帶正電的陽離子基團(tuán)即正電元件，CLIC1的跨膜結(jié)構(gòu)域綁定和插入該正電元件，能進(jìn)一步增強(qiáng)CLIC1的跨膜和插入。被帶負(fù)電荷的氨基酸替代后，CLIC1蛋白的二級、三級、四級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，減少了整體螺旋度，增加Trp35的極性，進(jìn)而會影響其功能。

本研究構(gòu)建了CLIC1第49～51位3個(gè)氨基酸的缺失突變體CLIC1(Δ49-51)，初步探索其對CLIC1蛋白功能的影響。首先把重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG、pcDNA3.1-CLIC1(Δ49-51)-FLAG分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T和COS7細(xì)胞中，比較CLIC1突變體相對于野生型的表達(dá)及定位改變；鑒于本課題組已經(jīng)證實(shí)野生型CLIC1蛋白與Sedlin蛋白存在相互作用[10]，利用Western blot、免疫熒光、GST pulldown及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，研究缺失突變體CLIC1(Δ49-51)是否與Sedlin蛋白存在體內(nèi)、體外的相互作用。結(jié)果顯示，不同于CLIC1與Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中存在共定位[11],CLIC1(Δ49-51)與野生型CLIC1在細(xì)胞內(nèi)定位、表達(dá)及與Sedlin相互作用方面均存在明顯的差異。本研究結(jié)果顯示，缺失突變體CLIC1(Δ49-51)中帶正電荷KRR基序的缺失，使其蛋白結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)的構(gòu)象發(fā)生改變，以及該位點(diǎn)與周圍氨基酸化學(xué)鍵的改變，進(jìn)而也一定程度上改變了蛋白質(zhì)的功能(圖7)。

圖7 CLIC1氨基酸殘基(23～57)

CLIC1與腫瘤關(guān)系的研究比較多，有相關(guān)報(bào)道[12-14]表明CLIC1在乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌中的表達(dá)明顯上調(diào)。CLIC1通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運(yùn)輸進(jìn)而影響其他調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)[15]，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡過程。因此，研究CLIC1的功能及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為進(jìn)一步探尋臨床腫瘤標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。