徐 博，郭 偉，劉丹平，薛 輝

0 引言

糖尿病腎病是一種致命性的糖尿病并發(fā)癥，約1/3的糖尿病患者會出現(xiàn)糖尿病腎病。糖尿病腎病已成為終末期腎病的主要病因，且與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和過早死亡例數(shù)增加密切相關(guān)，造成了較重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-3]。研究表明，許多中藥單體在糖尿病腎病的治療中發(fā)揮積極作用，如黃連素、姜黃素、淫羊藿苷及丹酚酸B等[4-5]。大黃是一種傳統(tǒng)中草藥，大黃提取物中發(fā)揮功效的主要為蒽醌類化合物，其蒽醌類化合物主要包括大黃酚、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及番瀉苷A(Sennoside A，SA)，這些大黃的蒽醌類化合物在通便、抗炎、抗癌、抗氧化方面起著重要作用[6-7]。研究表明，番瀉苷A在胃腸保護(hù)方面有積極作用[8]。但番瀉苷A在糖尿病腎病中的功能還未見報(bào)道。本研究的主要目的是探索番瀉苷A對鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎損傷和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動物來源及主要試劑 6周齡大鼠購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，番瀉苷A(分析純)購自美國Sigma-Aldrich公司。STZ(HPLC≥98%)購自美國Sigma公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)染色試劑盒購自美國羅氏公司?？笴aspase-3抗體、抗Caspase-9抗體和抗纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)抗體購自英國Abcam公司。白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-18、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.2 動物分組及藥物處理 40只大鼠隨機(jī)分為4組：對照組(Control組)，番瀉苷A對照組(SA組)，糖尿病腎病模型組(STZ組)和番瀉苷A處理組(STZ+SA組)。STZ組和STZ+SA組大鼠腹腔注射60 mg/kg的STZ，連續(xù)注射3周。Control組和SA組大鼠用生理鹽水代替STZ。然后SA組和STZ+SA組大鼠口服番瀉苷A(100 mg/kg)，連續(xù)喂養(yǎng)1周。

1.3 腎功能指標(biāo)檢測 番瀉苷A處理1周后，分別收集尿液和血液，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白、血清肌酸酐和血尿素氮水平。

1.4 TUNEL染色 番瀉苷A處理1周后，頸椎脫臼法處死大鼠后取出腎臟，PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%、70%的酒精依次脫水10 min。去除酒精脫水機(jī)中脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋切片。用二甲苯對石蠟切片進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇水化后用蛋白酶K 20～37 ℃處理15～30 min。PBS漂洗后用3%的H2O2室溫孵育20 min，隨后PBS清洗。然后按照試劑盒說明書進(jìn)行生物素標(biāo)記，顯色，蘇木素復(fù)染后自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞。

1.5 蛋白印記 腎臟組織勻漿后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，再于100 ℃下變性5 min。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜后，經(jīng)5%的BSA封閉1 h后分別加入相應(yīng)的一抗：Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶500)，4 ℃下過夜孵育。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后，加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并統(tǒng)計(jì)灰度值，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測 收集各組待測大鼠血清，然后按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測IL-18、IL-1β含量。首先，樣品加入反應(yīng)孔后于37 ℃孵育45 min，洗滌液洗滌4次后，再加入生物素標(biāo)記的抗體，于37 ℃反應(yīng)30 min，洗滌后再加鏈霉親和素-HRP并混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min。加入顯色劑避光顯色15 min，最后添加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測吸光值。

1.7 免疫組織化學(xué) 用PBS將各組大鼠腎臟組織清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊后，用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。再用PBS清洗3次，30%、50%、70%的酒精依次脫水10 min，去除酒精脫水機(jī)中脫水。然后進(jìn)行石蠟包埋切片。石蠟切片經(jīng)過脫蠟再水化后用1%的triton-100處理15 min，再用3%的H2O2處理15 min。用5%的羊血清封閉30 min后依次孵育一抗(4 ℃，過夜)和二抗(37 ℃，30 min)。最后進(jìn)行染色封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)。P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠尿蛋白水平的影響 由圖1可見，Control組、SA組、STZ組、STZ+SA組24 h尿蛋白水平分別為(8.3±3.2)、(6.9±2.1)、(53.1±8.5)、(24.8±4.1) mg/24 h，其中，STZ組高于對照組、STZ+SA組(P<0.01)。

圖1 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠尿蛋白水平的影響

2.2 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠血清肌酸酐水平的影響 Control組、SA組、STZ組、STZ+SA組大鼠血清肌酸酐水平分別為(0.55±0.06)、(0.49±0.09)、(1.07±0.12)、(0.67±0.11) mg/dl。結(jié)果顯示，STZ組大鼠血清肌酸酐水平高于對照組、STZ+SA組(P<0.01)。見圖2。

2.3 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠尿素氮水平的影響 Control組、SA組、STZ組、STZ+SA組大鼠尿素氮水平分別為(12±4.1)、(8.7±3.2)、(32.4±5.3)、(17.6±3.6) mg/dl。結(jié)果顯示，STZ組大鼠尿素氮水平高于對照組、STZ+SA組(P<0.01)。見圖3。

圖2 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠血清肌酸酐水平的影響

圖3 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠尿素氮水平的影響

2.4 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響 Control組、SA組、STZ組、STZ+SA組凋亡率分別為7.8%±3.2%、7.5%±2.1%、53.4%±8.9%、16.8%±4.1%。如圖4、圖5所示，STZ大鼠腎臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)多于Control組(P<0.01)。與STZ相比，STZ+SA組腎臟組織凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P<0.01)。由此可見，番瀉苷A可減弱糖尿病腎病大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡。

圖5 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響

2.5 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見表1、圖6。結(jié)果顯示，STZ組大鼠Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)強(qiáng)于Control組、STZ+SA組(P<0.01)。

表1 蛋白印記檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

注：**與STZ組比較，P<0.01

圖6 蛋白印記檢測大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠炎癥反應(yīng)的影響 見表2、圖7。結(jié)果顯示，STZ組大鼠IL-1β、IL-18水平高于Control組、STZ+SA組(P<0.01)。

2.7 番瀉苷A對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的影響 采用免疫組化染色檢測纖維化標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)， 結(jié)果顯示， Control組、SA組、STZ組、STZ+SA組大鼠Fibronectin表達(dá)水平分別為15.2%±2.6%、21.3%±1.9%、86.4%±3.2%、34.5%±4.1%。如圖8、圖9所示，STZ大鼠腎臟組織中Fibronectin表達(dá)高于Control組(P<0.01)。番瀉苷A處理組大鼠腎臟組織中Fibronectin表達(dá)低于STZ組(P<0.01)。以上結(jié)果說明，番瀉苷A可減輕糖尿病腎病大鼠腎纖維化。

表2 ELISA檢測炎癥因子水平(pg/ml)

注：**與STZ組比較，P<0.01

圖7 ELISA檢測大鼠炎癥因子水平

圖8 免疫組化染色檢測大鼠纖維化標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)

3 討論

目前，糖尿病腎病的治療策略是控制高血糖和高血壓，以及抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)[9-10]。研究表明，草藥用于各類疾病的預(yù)防及治療受到了廣泛關(guān)注[11]。研究表明，在氯化汞誘導(dǎo)的急性腎衰竭大鼠中，大黃的蒽醌類提取物可降低血清肌酸酐和尿素氮水平[12]。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)，大黃酸可抑制IgA腎病大鼠尿蛋白水平升高。在腺嘌呤誘導(dǎo)的腎病小鼠中，大黃酸可降低血清肌酸酐和尿素氮水平[14]。本研究結(jié)果顯示，番瀉苷A可降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平。

圖9 各組大鼠纖維化標(biāo)記蛋白Fibronectin表達(dá)

細(xì)胞凋亡在各類疾病中起著重要作用，許多大黃的蒽醌類化合物具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的功效。Lian等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖聯(lián)合大黃酸處理可抑制慢性腎衰竭大鼠 IRE1、CHOP表達(dá)，降低腎小管細(xì)胞凋亡。在缺血/再灌注小鼠中，大黃酚可減弱CHOP、Caspase-12表達(dá)升高，降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[16]。同時(shí)，大黃素可抑制順鉑誘導(dǎo)的腎病大鼠細(xì)胞凋亡[17]。本研究顯示，番瀉苷A可減弱STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠Caspase-3、Caspase-9表達(dá)。

研究表明，大黃的蒽醌類化合物在抗炎方面發(fā)揮了積極作用。Meng等[18]研究表明，在高尿酸腎病小鼠中，大黃酸可抑制IL-1β、PGE2、TNF-α水平升高，降低炎癥反應(yīng)。在糖尿病腎病大鼠中，大黃素可減弱IL-6和TNF-α水平的上升，抑制炎癥反應(yīng)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸可降低5/6腎臟切除大鼠中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的釋放，減輕炎癥反應(yīng)[20]。本研究結(jié)果顯示，番瀉苷A可降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠IL-1β、IL-18水平，抑制炎癥反應(yīng)。

大黃的蒽醌類化合物還具有改善腎纖維化的功效。Zhang等[21]研究顯示，在慢性腎衰竭大鼠中，大黃提取物可抑制Fibronectin表達(dá)，改善腎纖維化。有報(bào)道，大黃酸可減輕單側(cè)輸尿管阻塞引起的腎纖維化[22]；大黃素可減弱STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟組織Fibronectin的分泌[23]。本研究結(jié)果顯示，番瀉苷A可降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎臟組織Fibronectin的表達(dá)。

本研究顯示，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠中，番瀉苷A可降低尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮水平，減弱Caspase-3、Caspase-9表達(dá)，降低IL-1β、IL-18水平，減弱Fibronectin表達(dá)，表明番瀉苷A可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎損傷及炎癥反應(yīng)。下一步研究方向是番瀉苷A影響STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎損傷和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為開發(fā)新的糖尿病腎病治療藥物奠定基礎(chǔ)。