劉 姍， 何偉明， 陳 宇

(1.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花 617000； 2.干熱河谷特色生物資源研發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川攀枝花 617000)

金龍膽草(ConyzabliniiH. Lév)是一種菊科白酒草屬2年生草本植物，為川滇的民間藥材，被2015年版《中華人民共和國藥典》[1]收錄，該植物目前主要分布在四川攀(攀枝花市)西(涼山州自治區(qū))地區(qū)，呈野生狀態(tài)。該植物含有豐富的萜類、生物堿、皂苷、黃酮和揮發(fā)油等次生代謝物[2-4]，已有成藥商品“金龍膽草浸膏片”用于治療慢性支氣管炎，其中黃酮類和皂苷為該植物的主要藥用成分，其總皂苷具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性而在近年來得到持續(xù)研究[5]。化合物苦蒿素是一種新克羅烷型二萜內(nèi)酯，為藥典中規(guī)定的該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制物。金龍膽草在一些文獻(xiàn)中常被誤記載為1年生草本，但經(jīng)筆者所在實(shí)驗(yàn)室實(shí)際栽種后發(fā)現(xiàn)實(shí)為2年生植物，可見該藥材的研究仍須要大力加強(qiáng)。本研究對(duì)攀西地區(qū)金龍膽草進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)其3種主要成分進(jìn)行含量測定和分析，探究金龍膽草有效成分的相關(guān)性，為金龍膽草開展栽培藥材的長期研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試用野生金龍膽草樣品于同時(shí)期采集自四川省攀枝花市和涼山州，按照均衡抽樣的原則，兩兩居群之間的地理距離>30 km，居群內(nèi)樣品間距離>15 m，每個(gè)居群采集>20株的樣品，分布點(diǎn)見表1，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳惠教授鑒定為金龍膽草。所有試驗(yàn)于2017年1—7月在干熱河谷特色生物資源研發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

表1 16個(gè)金龍膽草采樣點(diǎn)地理位置

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及PCR程序 按照DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek)進(jìn)行DNA提取，并以λDNA/HindⅢ為maker，以質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA分子量，并按照DNA(μg/mL)=50×D260 nm×稀釋倍數(shù)測定樣品濃度。引物序列如表2所示，按照預(yù)先篩選的12對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。RCR反應(yīng)程序和產(chǎn)物的銀染檢測程序均按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，V乙腈∶V甲醇∶V水=15 ∶40 ∶45，等梯度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 樣品及對(duì)照品溶液的制備 為了更好地研究金龍膽草總皂苷、總黃酮和苦蒿素含量的相關(guān)性，筆者采用其所在課題組前期對(duì)該藥材各成分優(yōu)化后的提取工藝分別對(duì)3種成分進(jìn)行提取，其中總黃酮含量采用超聲波輔助提取，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定含量，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品，回歸曲線為y1=10.946x1-0.007 1，r12=0.999 7，式中x1表示蕓香苷含量，y1表示吸光度[7]；總皂苷采用纖維素酶法輔助微波提取，醋酸-香草醛-高氯酸顯色測定含量，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品， 回歸曲線為y2=0.234 3x2-0.122 7，r22=0.999 7，式中x2表示齊墩果酸濃度，y2表示吸光度[8]；苦蒿素采用索氏提取，高效液相色譜法測定精確含量，以苦蒿素為標(biāo)準(zhǔn)品，回歸方程為y3=44.380x3+140.89，r32=0.999 3，式中y3表示吸收峰面積，x3表示苦蒿素含量[9]。

表2 SRAP引物序列

1.2.4 樣品及對(duì)照品溶液的制備 利用Alpha Innotech Chemilmage5500 CCD成像儀將電泳圖譜照片轉(zhuǎn)換成 .tif格式，再用Quantity One軟件將100～1 000 bp范圍內(nèi)清晰可見的條帶進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)過Match比對(duì)，有條帶記為1，無條帶記為0，形成一個(gè)“0、1”矩陣，計(jì)算每2個(gè)樣品間的Nei’s遺傳相似性系數(shù)S，S=2Njfb/Nj+Nf(Njf是二者共同的帶數(shù)，Nj、Nf分別為二者特有的帶數(shù))。遺傳距離為(1-S)。采用Popgen32軟件進(jìn)行基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、等位基因平均數(shù)(Na)及每位點(diǎn)有效等位基因數(shù)(Ne)分析，并計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比例；用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算金龍膽草的Jaccard遺傳相似系數(shù)(GS)，并按照不加權(quán)成對(duì)群算數(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。利用SPSS 20.0進(jìn)行樣品間有效成分含量相關(guān)性的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金龍膽草SRAP遺傳多樣性分析

12對(duì)引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，每對(duì)引物擴(kuò)增得到7～25條擴(kuò)增帶(圖1)，分子量在200～1 000 bp。共得到318條清晰且重復(fù)性好的條帶，其中275條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點(diǎn)率為86.48%， 遺傳多樣性結(jié)果分析見表3，說明金龍膽草資源存在著一定的遺傳差異，這為其育種研究提供了較好的選擇基礎(chǔ)。

表3 SRAP遺傳多樣性分析

分析結(jié)果顯示，各來源地樣品之間的相似性系數(shù)值在 0.496～0.880，平均相似系數(shù)為0.680，系統(tǒng)聚類樹矩陣和距離矩陣的相關(guān)度可信度較高(Mat檢測相關(guān)系數(shù)r=0.748)，遺傳距離(1-S)的極值間差距不大(0.384)，這與SRAP多態(tài)性分析結(jié)果相符。系統(tǒng)聚類(圖2)在相似系數(shù)0.699 0處將樣品聚為三大類：1～9號(hào)為第Ⅰ類，該類含攀枝花市區(qū)域樣品(除6樣)和與該區(qū)域地理位置相近的涼山州樣品(8、9號(hào))。涼山州的樣品聚為2類，第Ⅱ類為10～11號(hào)，第Ⅲ類為12～16號(hào)。聚類分析中同一群類中間雜有部分不同地理來源的樣品，例如6號(hào)樣品從地理位置的角度更應(yīng)聚在第Ⅰ類，可見野生金龍膽草樣品的分支并未嚴(yán)格按照地理來源劃分，遺傳多樣性雖然與地理位置有很大關(guān)系，但植物的親緣關(guān)系具有一定的復(fù)雜性，部分樣品在自然分化時(shí)地理區(qū)域的影響小于遺傳漂移，不能簡單地依據(jù)地理位置劃分。

2.2 有效成分含量測定

表4顯示，以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品測得的總黃酮含量普遍較高，平均含量達(dá)到6.31%；而以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品測得的總皂苷含量居群間差異不大，平均含量為0.77%，與早前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果符合；高效液相色譜法測得的苦蒿素含量較早前文獻(xiàn)[10]相比含量普遍較高，平均值為0.80%， 均遠(yuǎn)超出2015版《中華人民共和國藥典》中對(duì)金龍膽草藥材所作出的質(zhì)量要求(>0.3%)。本次3種主要成分含量的試驗(yàn)測試結(jié)果比之前文獻(xiàn)資料中的含量都高，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)立足產(chǎn)地，使用的均是新鮮植物材料，避免了長途運(yùn)輸、存放時(shí)長等不利因素帶來的差異。

表4 金龍膽草3種主要成分含量測定結(jié)果(n=3)

2.3 有效成分的相關(guān)性和聚類分析

攀西地區(qū)野生金龍膽草有效成分含量相關(guān)性分析基于16個(gè)來源地樣品中的總黃酮、總皂苷和苦蒿素這3種有效成分含量，結(jié)果(表5)顯示所測有效成分含量間相互存在正相關(guān)關(guān)系(r>0)，其中只有總黃酮和苦蒿素的含量存在較顯著相關(guān)性(P<0.05)。由圖3可以看出，當(dāng)聚類歐氏距離<15時(shí)，不同來源樣品被分為4類，其中有效成分含量較為接近的6、7、9、10、15、16號(hào)聚為Ⅰ類，但該類海拔和地理位置均有差異；3號(hào)獨(dú)自聚為Ⅱ類，2號(hào)和8號(hào)聚為Ⅲ類，這2類的所在地均具有較高的海拔(>2 000 m)，且所測成分含量都不高；1、4、5、11～14聚為Ⅳ類，其特征為采樣點(diǎn)海拔均<2 000 m。

表5 金龍膽草有效成分相關(guān)性分析

由于攀西地區(qū)土地面積并不大，氣候差異較多地體現(xiàn)在海拔不同，樣品間差異不太明顯，使得聚類結(jié)果和地理分布沒有太大相關(guān)性。以主要成分含量為考查指標(biāo)可以看出，7號(hào)樣品(攀枝花市機(jī)場路樣品)具有高出各樣品平均水平的有效成分，其與處于最低水平的14號(hào)樣品(涼山州西昌市)來自幾乎同樣的海拔高度，這說明海拔不是金龍膽草藥材優(yōu)劣的主要影響因素，氣候和土壤環(huán)境等生態(tài)因子更值得考量，這一結(jié)果可指導(dǎo)后續(xù)遺傳育種研究時(shí)可用7號(hào)樣品所在地為研究對(duì)象進(jìn)行深入的生態(tài)因子研究，摸索出最佳的金龍膽草栽培生境。

3 討論

分光光度法和高效液相色譜法都是植物次生代謝物含量研究的常用方法[11-13]，分光光度法有較大的背景干擾，對(duì)測定單一成分存在誤差，高效液相色譜法能較準(zhǔn)確分析單組分含量，但無法全面反映一類物質(zhì)的總量。因此，本研究分別采用分光光度法測定金龍膽草總黃酮和總皂苷的含量，采用高效液相色譜法測定苦蒿素成分的含量。分光光度法測量總黃酮時(shí)，顯色反應(yīng)發(fā)生在鄰二酚羥基、3-羥基-4-酮基、5-羥基-4酮基部位，不發(fā)生在-羰基、5-羥基部位[14-15]，因此具備此母核的黃酮類成分均能被檢測到。金龍膽草總黃酮類成分主要為此結(jié)構(gòu)，含有少量的槲皮素和山奈酚，不具備上述結(jié)構(gòu)，可能無法計(jì)入總量[15]，但由于這2種成分在金龍膽草中含量極少，對(duì)結(jié)果影響不大，因此使用蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品可滿足金龍膽草總黃酮的檢測需求。金龍膽草皂苷以齊墩果烷型三萜皂苷為主，因此使用齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采取經(jīng)典醋酸-香草醛-高氯酸顯色法進(jìn)行檢測也具備準(zhǔn)確性和代表性。

4 結(jié)論

本研究對(duì)攀西地區(qū)野生金龍膽草的16個(gè)主要居群進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，并檢測了樣品間總黃酮、總皂苷和苦蒿素含量。結(jié)果顯示，金龍膽草在攀西地區(qū)遺傳多樣性并不豐富，這可能與該植物還是以野生為主、區(qū)域間流動(dòng)較小有關(guān)。對(duì)金龍膽草主產(chǎn)區(qū)不同來源樣品的有效成分相關(guān)性分析結(jié)果顯示，成分含量均為正相關(guān)，但除苦蒿素和總黃酮外，其余成分間相關(guān)性不顯著(P>0.05)。以成分含量進(jìn)行的聚類分析結(jié)果和分子標(biāo)記結(jié)果相比較，顯示成分的含量高低與遺傳關(guān)系聚類有一定相關(guān)性，如2種分析下11～14號(hào)樣都聚為一類，但有效成分的積累可能與生態(tài)因子更為相關(guān)，這也符合其他學(xué)者提出的中藥材道地性與其生物學(xué)基礎(chǔ)相關(guān)性的假說[16-18]。要深入研究本藥用植物，還須在今后的研究中對(duì)金龍膽草生境的影響因子如溫度、濕度、光照、土壤成分等進(jìn)行詳細(xì)測量，與本試驗(yàn)數(shù)據(jù)相結(jié)合，以便獲得全方位的植物生長信息參數(shù)。