高慧新， 封 毅， 王孝勛， 吳燕春， 戴忠華， 田 慧

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530200)

褐苞薯蕷來源于薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷(DioscoreapersimilisPrain et Burkill)，別稱廣山藥、廣西淮山，根莖入藥，主產(chǎn)于廣西桂平、玉林、靈山、陸川、平南等地，野生于海拔100～1 950 m的山坡、路旁、山谷雜木或灌叢中，我國南方各地也均有栽培。中醫(yī)用其“補脾養(yǎng)胃，生津益肺，補腎澀精”；壯醫(yī)用其“調(diào)谷道氣道水道，補肺腎”[1]。褐苞薯蕷在廣西、福建、海南等地被作為山藥地區(qū)習(xí)用品，藥用與食用由來已久[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，褐苞薯蕷乙醇提取物各萃取層(石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層)均表現(xiàn)出較好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性[3]。褐苞薯蕷產(chǎn)量大，適應(yīng)能力強，占領(lǐng)了藥材和食品市場上很重要的部分，是一種重要的藥用植物資源，有研究的必要性。

ISSR即簡單重復(fù)序列間擴增(inter simple sequence repeat)，是近年應(yīng)用較多的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，它以微衛(wèi)星重復(fù)序列為引物，通常為16～18個堿基序列，由 1～4 個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列和幾個非重復(fù)的錨定堿基組成，提高了PCR擴增反應(yīng)的專一性。同時ISSR標(biāo)記以其較低的成本、良好的穩(wěn)定性及重復(fù)性、能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化等特點，被視為理想的遺傳標(biāo)記方法[4]。ISSR-PCR反應(yīng)易受多種因素的影響，本試驗利用單因素結(jié)合正交設(shè)計的方法，旨在建立適合于褐苞薯蕷 ISSR-PCR 反應(yīng)的最佳體系，為褐苞薯蕷種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 試驗材料為褐苞薯蕷新鮮葉片，采自廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫校區(qū)，并由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧副教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬植物褐苞薯蕷(DioscoreapersimilisPrain et Burkill)。

1.1.2 試劑與儀器

1.1.2.1 試劑 新型植物基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA marker(D2000)、5×TBE均購自天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖(西班牙)，GelRed核酸染料(美國)，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純，ISSR-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2.2 儀器 Eppendorf移液槍(德國)，電子分析天平(賽多利斯BSA224S)，超純水機(法國MILIPORE)，渦旋混合器(上海滬西XW-80A)，高速冷凍離心機(德國Sigma Sartorius)，紫外分光光度計(日本島津UV1780)，梯度PCR儀(Bio-red T100)，電泳儀(Bio-red)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-red，gel Doc EZ)

1.2 試驗方法

1.2.1 褐苞薯蕷植物總DNA的提取 根據(jù)新型植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟對試驗材料進(jìn)行植物總DNA的提取，并采用瓊脂糖電泳及紫外分光光度法檢測總DNA的純度及濃度，將其稀釋至30 ng/μL備用。

1.2.2 單因素條件考察 參照文獻(xiàn)[5-7]，設(shè)定本次試驗ISSR-PCR基本反應(yīng)體系組成為：總體積20 μL，TaqDNA聚合酶1.5 U，DNA模板量90 ng，dNTPs濃度 0.25 mmol/L，引物濃度0.5 μmol/L，Mg2+濃度1.5 mmol/L，10×Taqbuffer 2.0 μL，其余用ddH2O補齊。擴增程序為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃變性40 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34個循壞；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。以初步篩選出的引物807(AGAGAGAGAGAGAGAGT)作為單因素及正交試驗的引物。對影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的5個因素：TaqDNA聚合酶用量、DNA模板量、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+濃度分別設(shè)置6個濃度梯度，采取改變單一因素的方法，來確定該因素對ISSR-PCR的影響，各因素水平如表1所示。將PCR所得產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中，以電壓75 V電泳50 min。使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并采集圖像。

表1 單因素試驗設(shè)計

1.2.3 正交試驗設(shè)計 采用L16(45)正交試驗設(shè)計，根據(jù)單因素試驗結(jié)果分別確定5個相關(guān)因素的4個水平，共16個處理組(表2)。其基礎(chǔ)反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與單因素試驗一致。

1.2.4 退火溫度的優(yōu)化 利用PCR，以引物807的Tm值(50±5) ℃為范圍，自動生成8個溫度梯度以優(yōu)化退火溫度。

表2 正交試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 Taq DNA聚合酶用量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

由圖1可知，TaqDNA聚合酶用量在0.5、1.5 U時，均無條帶；在1.0、2.5、3.0 U時，雖有條帶，但并不清晰，且拖尾嚴(yán)重；在2.0 U時，條帶清晰明亮，故體系中TaqDNA聚合酶用量應(yīng)在2.0 U左右。

2.2 DNA模板量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

由圖2可知，DNA模板量在45、105、120 ng時均能顯示清晰明亮的條帶，在60～90 ng時，條帶太亮不清晰，綜合考慮到試驗成本，故體系中的最佳DNA模板量應(yīng)在45 ng左右，且不超過60 ng。

2.3 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

由圖3可知，dNTPs的濃度為0.062 5、0.375 0 mmol/L時，擴增出的條帶少、不清晰；濃度在0.125 0～0.312 5 mmol/L 時，擴增出的條帶多且清晰穩(wěn)定；故體系中dNTPs的濃度范圍為0.125 0～0.312 5 mmol/L。

2.4 引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

由圖4可知，隨著引物濃度的增加，擴增條帶也逐漸增強、清晰，在濃度達(dá)到0.625 μmol/L時，條帶特異性減弱，引物二聚體增多；故設(shè)定體系中引物濃度范圍為0.375 0～0.562 5 μmol/L。

2.5 Mg2+濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

由圖5可知，當(dāng)Mg2+濃度為0.625、1.250 mmol/L時，擴增條帶少；濃度為1.875 mmol/L時，擴增條帶增多且明亮清晰；濃度再增大擴增條帶模糊；故體系Mg2+濃度應(yīng)在 1.875 mmol/L 左右。

2.6 正交試驗

正交試驗結(jié)果如圖6所示，依據(jù)擴增條帶的強弱和雜帶的多少，對正交試驗PCR結(jié)果進(jìn)行直觀分析。13號、15號和16號組合擴增條帶太過明亮且背景彌散嚴(yán)重，不易辨識；11號、12號和14號組合擴增條帶暗淡模糊，不易識別；1～10號組合擴增出的條帶數(shù)量多且清晰明亮，其中8號組合擴增條帶多且?guī)吻逦髁?，重?fù)試驗發(fā)現(xiàn)其擴增效果穩(wěn)定。故褐苞薯蕷ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為：20 μL體系，其中10×TaqBuffer 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.875 U，DNA模板量52.5 ng，dNTPs濃度0.25 mmol/L，引物濃度0.437 5 μmol/L，Mg2+濃度 1.5 mmol/L，其余用ddH2O補齊。

2.7 退火溫度的優(yōu)化

將退火溫度設(shè)定在45～55 ℃，PCR儀自動生成8個溫度梯度：55.0、54.2、52.9、51.2、48.9、46.9、45.7、45.0 ℃。由圖7可知，當(dāng)溫度在52.9、51.2 ℃時，條帶數(shù)量相對較多且清晰，故本次試驗采用52 ℃作為退火溫度是合理的。

3 討論與結(jié)論

本試驗主要從影響PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、引物、Mg2+為考察點，建立并優(yōu)化褐苞薯蕷的ISSR-PCR體系。在PCR體系中，TaqDNA聚合酶濃度過高，會引起非特異性產(chǎn)物的擴增；模板DNA的純度和用量都會對PCR擴增有影響；dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度，同時也增加堿基的錯誤摻入率和試驗成本，低濃度的dNTPs會導(dǎo)致反應(yīng)速率下降，但可提高試驗準(zhǔn)確性；引物是保證PCR特異性的關(guān)鍵因素，濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物增加、引物之間易形成二聚體，濃度太低又可能得不到擴增結(jié)果或產(chǎn)量過低；最佳的Mg2+濃度對于不同的引物和模板都不相同，較高的濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實度。

本試驗運用單因素結(jié)合正交設(shè)計的方法，首先確定各因素用量或濃度的有效范圍，再利用正交設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化組合，確立適用于褐苞薯蕷的ISSR-PCR反應(yīng)體系。試驗結(jié)果顯示，5個因素對褐苞薯蕷ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響大小為TaqDNA聚合酶>Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs。

本試驗選出的褐苞薯蕷最佳20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶1.875 U，DNA模板量52.5 ng，dNTPs濃度0.25 mmol/L，引物濃度0.437 5 μmol/L，Mg2+濃度 1.5 mmol/L，10×TaqBuffer 2.0 μL，其余用ddH2O補齊。