王巧玲， 范廣璞， 楊 猛， 許楠楠

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003)

近年來，全世界農(nóng)藥化肥使用量的不斷增加，造成了土壤板結(jié)、河流和地下水污染等一系列問題。我國作為農(nóng)業(yè)大國，對農(nóng)藥、化肥的依賴性較強(qiáng)，在使用農(nóng)藥防治病蟲草害的同時(shí)，常產(chǎn)生糧食、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題，且多數(shù)農(nóng)藥不易被生物降解，對人類及其他生物產(chǎn)生毒害。大量研究表明，微生物肥料的開發(fā)與應(yīng)用對創(chuàng)造良好的生態(tài)環(huán)境、改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力及減少農(nóng)藥污染等具有重要作用，是農(nóng)藥和化肥的有效替代品[1]。

微生物肥料是指一種以活性微生物為主的特定菌劑，能夠通過微生物的生命活動(dòng)，產(chǎn)生農(nóng)作物所需的特定肥料，并促進(jìn)土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，刺激和調(diào)控作物的生長，防治作物的病蟲害，降解農(nóng)藥，從而達(dá)到植物增產(chǎn)、減輕化學(xué)污染的目的[2]。微生物肥料的核心是微生物，具有微生物的特性，其降解農(nóng)藥的機(jī)制主要分為2種：一種是通過酶促反應(yīng)直接降解農(nóng)藥；另一種是通過改變化學(xué)和物理環(huán)境間接作用于農(nóng)藥[3]。目前微生物肥料多采用多種菌株復(fù)合的方式充分發(fā)揮各菌株的作用，從而提高微生物肥料的效力[4]。本研究從農(nóng)藥污染的土壤中篩選出具有固氮、解有機(jī)磷農(nóng)藥、解有機(jī)氯農(nóng)藥的菌株，經(jīng)鑒定后進(jìn)行黃瓜幼苗的促生長試驗(yàn)，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基[5]： 蛋白胨1.00 g，酵母粉0.50 g，NaCl 1.00 g，H2O 100 mL，(固體)瓊脂15 g/L。Ashby無氮培養(yǎng)基[6]：KH2PO40.03 g，CaCO30.50 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，甘露醇1.00 g，NaCl 0.30 g，(固體)瓊脂1.50 g，CaSO40.01 g，去離子水100 mL。液體選擇培養(yǎng)基：普通LB培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃，加入1 g/L有機(jī)磷農(nóng)藥或1 g/L有機(jī)氯農(nóng)藥。固體選擇培養(yǎng)基：普通LB固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃，加入1 g/L有機(jī)磷農(nóng)藥或1 g/L有機(jī)氯農(nóng)藥。

1.1.2 試劑 氧樂果、2，4-D，均購自江蘇揚(yáng)農(nóng)化工集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采樣地點(diǎn)為江蘇省蘇北地區(qū)某農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)周邊農(nóng)田。采樣方法：取地表及地表下5～10 cm處的土樣1 kg左右，裝于預(yù)先滅菌的袋子中，扎緊。

1.2.2 土壤懸液的制備 稱取10 g土壤樣本溶于90 mL無菌水中，充分振蕩，將土壤懸液按10倍梯度逐步稀釋，制成10-1～10-7土壤稀釋液。

1.2.3 功能 菌株的初步分離與篩選取0.1 mL 10-3～10-7土壤稀釋液，依次均勻涂布到Ashby培養(yǎng)基、有機(jī)磷農(nóng)藥培養(yǎng)基、有機(jī)氯農(nóng)藥培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察生長情況并選取透明圈較大的單菌落，多次傳代培養(yǎng)后取長勢較好的菌株保存。

1.2.4 功能菌株的復(fù)篩

1.2.4.1 固氮菌株的復(fù)篩 采用乙炔還原法[7]測定固氮菌株的固氮酶活性，篩選出固氮能力較強(qiáng)的菌株。首先將初篩獲得的菌株分別接種于4.5 mL Ashby無氮培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，從試管中抽出1.8 mL氣體，然后注入1.6 mL C2H2(對照管除外)，再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，從試管中抽取 0.5 mL 混合氣體注入氣相色譜儀中，測定C2H2、C2H4的生成情況。根據(jù)C2H4峰值判斷C2H4的產(chǎn)生情況，以接種菌株但未注入C2H2的試管作為對照組，重復(fù)5次。固氮酶活性計(jì)算公式如下：

N=(hx×C×V)/(hs×常數(shù)×t)。

式中：hx為樣品峰值；hs為標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰值；C為標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度，nmol/mL；V為試管體積，mL；常數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)C2H4測試時(shí)的體積，mL；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間，h；N為產(chǎn)生的C2H4濃度，即固氮酶活性，nmol/(h·mL)。

1.2.4.2 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株接種至加入有機(jī)磷農(nóng)藥的液體選擇培養(yǎng)基中，以不接種菌的空液體選擇培養(yǎng)基作為對照，重復(fù)5次，37 ℃振蕩培養(yǎng)72 h后，采用分光光度法[8]分別測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中有機(jī)磷含量，考察各菌株對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力。有機(jī)磷農(nóng)藥降解率計(jì)算公式如下：

降解率=(C1-C2)/C1×100%。

式中：C1為培養(yǎng)前有機(jī)磷濃度，nmol/mL；C2為培養(yǎng)后有機(jī)磷濃度，nmol/mL。

1.2.4.3 有機(jī)氯農(nóng)藥降解菌的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株接種至溴甲酚紫培養(yǎng)基中，以不接種菌株的培養(yǎng)液作為對照，重復(fù)5次，30 ℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色時(shí)，停止培養(yǎng)[9]。將培養(yǎng)液于4 000 r/min離心20 min，取上清，采用分光光度法于283 nm處測定吸光度，并計(jì)算有機(jī)氯農(nóng)藥的降解率，通過比較篩選出降解力最強(qiáng)的菌株。有機(jī)氯農(nóng)藥降解率計(jì)算公式如下：

降解率=(L1-L2)/L1×100%。

式中：L1為培養(yǎng)前有機(jī)氯濃度，nmol/mL；L2為培養(yǎng)后有機(jī)氯含量，nmol/mL。

1.2.4.4 拮抗病原菌能力測定 采用平板對峙法[10]測定菌株與病原菌的拮抗作用。將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。再將黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌接種到PDA平板中心(病原菌菌餅直徑為5～6 mm)，距中心約為3 cm，滴加菌株懸液，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點(diǎn)樣中心點(diǎn)到被復(fù)篩菌株抑制邊緣的半徑(r)，按下式計(jì)算抑制率：

抑制率=(R-r)/R×100%。

1.2.4.5 菌株拮抗性試驗(yàn) 對篩選出的菌株進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)，將無拮抗反應(yīng)的菌株進(jìn)行組合，作為復(fù)合微生物肥料的功能菌株。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 菌株形態(tài)特征和生理生化特性 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]對篩選所得菌株的菌落特征、菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，對菌落的染色性及生理生化特性進(jìn)行研究，獲得鑒定結(jié)果。

1.2.5.2 菌株的分子鑒定 用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取出復(fù)篩菌株的基因組DNA，采用PCR擴(kuò)增16S rDNA的方法對復(fù)篩菌株進(jìn)行分子鑒定。設(shè)計(jì)的上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′，下游引物序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL、dNTP mix 4 μL、Taq酶0.3 μL、cDNA2 μL、引物1 μL、ddH2O 37 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。獲得的產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果與序列庫進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 盆栽試驗(yàn) 選取顆粒飽滿均勻的黃瓜種子，用蒸餾水洗凈并浸泡一段時(shí)間后，用75%乙醇浸泡1 min、5%次氯酸鈉浸泡3 min，每次浸泡后均用無菌水沖洗5～6次，進(jìn)行種子表面消毒。將消毒后的黃瓜種子置于培養(yǎng)皿中，于暗處催芽 2 d。催芽后播種于育苗盤，待幼苗長出2～3張真葉后，挑選大小、長勢一致的幼苗移入含有有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥的滅菌栽培基質(zhì)的塑料盆中。將供試菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，將菌懸液用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌2～3次后稀釋至菌液濃度約為 108CFU/g。分別取稀釋后的菌懸液5 mL澆灌于幼苗根部，每10 d接種1次，以加入等量無菌水為對照，每組6次重復(fù)。放置于溫室中培養(yǎng)30 d后，將作物整株從盆中取出，用清水洗凈，吸水紙吸干，測量各試驗(yàn)組和對照組的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 各組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株的初篩結(jié)果

在Ashby培養(yǎng)基、有機(jī)磷農(nóng)藥培養(yǎng)基、有機(jī)氯農(nóng)藥培養(yǎng)基上均勻涂布土壤稀釋液，于30 ℃培養(yǎng)7 d后，根據(jù)其長勢和透明圈的大小分別挑選出固氮菌株8株(GN1～GN8)、有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌株8株(JP1～JP8)、有機(jī)氯農(nóng)藥降解菌株8株(JL1-JL8)。

2.2 功能菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 固氮菌株 復(fù)篩試驗(yàn)為篩選出固氮能力較強(qiáng)的菌株，采用乙炔還原法測定初篩獲得的菌株的固氮酶活性。圖1表明，8株自生固氮菌的固氮酶活性介于55.41～126.17 nmol/(h·mL)，將固氮菌株按照固氮酶活性的高低進(jìn)行排序可得：GN4>GN6>GN7>GN5>GN3>GN1>GN2、GN8，其中GN4、GN6、GN7的固氮酶活性均高于 100 nmol/(h·mL)，因此選取GN4、GN6、GN7菌株與病原菌進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)。

2.2.2 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌 復(fù)篩試驗(yàn)為獲得有機(jī)磷農(nóng)藥降解率較高的菌株，將初篩獲得的菌株接種至加入有機(jī)磷農(nóng)藥的液體選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，采用分光光度法分別測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中的有機(jī)磷含量，考察各菌株對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力。圖2顯示，8株菌株的有機(jī)磷農(nóng)藥降解率介于34.93%～66.18%之間，且與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，其中菌株JP3的有機(jī)磷農(nóng)藥降解率最高，為66.18%，JP8、JP2的有機(jī)磷農(nóng)藥降解率次之，分別為64.03%、55.94%，因此選取菌株JP3、JP8、JP2與病原菌進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)。

2.2.3 有機(jī)氯農(nóng)藥降解菌 復(fù)篩采用分光光度法對初篩的有機(jī)氯農(nóng)藥降解菌株的降解率進(jìn)行測定，結(jié)果(圖3)表明，8株菌株的有機(jī)氯農(nóng)藥降解率介于38.44%～74.86%之間，其中降解率最高的是JC7菌株，為74.86%，其次是JC3、JC1，各組與對照組相比均有極顯著差異(P<0.01)，因此篩選菌株JC7、JC3和JC1進(jìn)行病原菌拮抗性試驗(yàn)。

2.2.4 病原菌拮抗性測定結(jié)果 將篩選出的9株菌株分別與黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌進(jìn)行拮抗作用試驗(yàn)，由表1可知，對2種病原菌均有抑制能力的菌株為GN6、JP2、JC7、JC1。

表1 各菌株對病原菌的拮抗率

2.2.5 菌株拮抗性試驗(yàn) 對篩選出的GN6、JP2、JC7、JC1進(jìn)行菌株間拮抗性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GN6、JP2、JC1之間無相互拮抗作用，而JC7和GN6、JP2有拮抗現(xiàn)象，因此最終篩選出GN6、JP2、JC1作為復(fù)合微生物肥料的有效菌株。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)特征和生理生化特性測定 通過對3個(gè)菌株的菌落形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)，GN6、JP2、JC1菌落均為乳白色，邊緣不整齊(表2)。顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示，3株菌株均為桿狀，GN6為革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽孢，JP2和JC1為革蘭氏陽性菌，芽孢中生或次端生。生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，GN6能發(fā)酵葡萄糖、液化明膠、利用甘露醇，吲哚、甲基紅試驗(yàn)呈陰性，不能利用檸檬酸，接觸酶、氧化酶、過氧化氫酶試驗(yàn)均為陽性。JP2和JC1能發(fā)酵葡萄糖、水解淀粉、液化明膠、利用甘露醇和檸檬酸鹽，吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)為陰性，JC1的V-P試驗(yàn)呈陰性，其他反應(yīng)均為陽性。

表2 菌株菌落形態(tài)特征及部分生理生化特征

注：“+”“-”分別表示相應(yīng)反應(yīng)呈陽性、陰性。

2.3.2 菌株的分子鑒定 將GN6、JP2、JC1菌株的16S rDNA基因序列經(jīng)Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，GN6與假單胞菌K32(Pseudomonassp.)的同源性高達(dá)100%，JP2與芽孢桿菌 TU-10(Bacillussp.)的同源性高達(dá)98%，JC1與芽孢桿菌BSn5(Bacillussp.)的同源性高達(dá)98%，根據(jù)序列比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)合3株菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性初步確定，GN6屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，JP2、JC1屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.4 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

將菌株GN6、JP2、JC1及3株菌株的混合菌液稀釋后接種于黃瓜幼苗根部，培養(yǎng)30 d后測量其株高和地上部干質(zhì)量。由表3可以看出，接種GN6、JP2、JC1及3株菌株混合液后，黃瓜幼苗株高與對照組相比分別增加21.2%、11.4%、14.4%、31.8%，地上部干質(zhì)量與對照組相比分別增加 16.3%、15.1%、17.9%、25.3%，且3株菌株混合接種處理后的株高和地上部干質(zhì)量與單獨(dú)接種處理相比均顯著增高(P<0.05)。該結(jié)果表明，菌株GN6、JP2、JC1對于黃瓜幼苗的生長具有促進(jìn)作用，且3株菌株混合后對于黃瓜幼苗的促生長作用更為明顯。

表3 各菌株對黃瓜幼苗的促生作用

注：a表示與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；b表示混合菌液處理與單獨(dú)菌株處理相比有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

目前，微生物肥料已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[12-13]，而不同功能的多菌株組合是主要的研究方向和重點(diǎn)。根據(jù)不同微生物所具有的生化和功能特性，采用新的技術(shù)手段，將多種菌株進(jìn)行科學(xué)合理的組合，排除菌株間的相互拮抗，發(fā)揮聯(lián)合菌株的共生協(xié)同作用，從而提高微生物肥料的功效，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物的增產(chǎn)[14]。

本研究通過觀察菌株的透明圈大小初篩出固氮菌株、有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌株、有機(jī)氯農(nóng)藥降解菌株各8株。根據(jù)其固氮能力、有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力和有機(jī)氯農(nóng)藥降解能力復(fù)篩出9株菌株分別與黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌進(jìn)行拮抗性試驗(yàn)，篩選出GN6、JP2、JC7、JC1共4株菌株，最終通過菌株間的拮抗性試驗(yàn)篩選出GN6、JP2、JC1作為復(fù)合微生物肥料的菌株。將3株菌株分別接種至黃瓜幼苗根部，30 d后黃瓜幼苗株高和地上部干質(zhì)量均顯著高于對照組，而3株菌株混合液接種處理后的黃瓜幼苗株高和地上部干質(zhì)量顯著高于單菌株處理組。

綜上所述，本研究篩選出的3株菌株對黃瓜幼苗的生長具有促生作用，可以作為復(fù)合微生物肥料的菌株，具有較大的應(yīng)用潛力，對于黃瓜的大規(guī)模種植有一定的積極作用，同時(shí)可以修復(fù)被污染的土壤、改善土壤結(jié)構(gòu)[15]。但是仍需要通過大田試驗(yàn)作進(jìn)一步的研究，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討。