羅學(xué)軍，田介峰，閻 紅，王瑞靜，李瑞明，宋兆輝，何 毅*

(1.天士力控股集團(tuán)有限公司天士力研究院，天津 300410； 2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410)

化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值國(guó)際上通常采用質(zhì)量守恒法，即分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有關(guān)物質(zhì)、水分、殘留溶劑及無(wú)機(jī)雜質(zhì)的含量，其與主成分的含量之和應(yīng)為100%[1]。定量核磁共振(QNMR)技術(shù)作為一種日益成熟的儀器分析方法,具有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),如無(wú)需待測(cè)物對(duì)照品、樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、測(cè)定快速準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、不破壞樣品,在藥品質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[2-5]。復(fù)方丹參滴丸是全球首個(gè)由中國(guó)自主研發(fā)的產(chǎn)品完成美國(guó)FDA Ⅲ期臨床試驗(yàn)，也是首個(gè)獲得美國(guó)FDA Ⅲ期臨床試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的復(fù)方中藥[6]，其質(zhì)控相關(guān)的對(duì)照品由企業(yè)自制獲得，自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性直接影響臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果，因此至關(guān)重要。本文通過(guò)上述2 種方法的定值比較研究，可以更好地保障企業(yè)自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高 效 液 相 色 譜 儀，美國(guó)Agilent；Advance DRX 500 Bruker型核磁共振儀，德國(guó)Bruker；METTLER XP205電子天平。丹參素鈉(批號(hào)20150323)、原兒茶醛(批號(hào)20150306)、丹酚酸A(批號(hào)20150329)、丹酚酸B(批號(hào)20150804)、丹酚酸T/U(批號(hào)20150330)、三七皂苷R1(批號(hào)20150421)、人參皂苷Rg1(批號(hào)20150415)、人參皂苷Re(批號(hào)20150428)和人參皂苷Rb1(批號(hào)20150415)對(duì)照品由天士力集團(tuán)研究院現(xiàn)代中藥開(kāi)發(fā)中心自制；富馬酸對(duì)照品(批號(hào)20618)和馬來(lái)酸對(duì)照品(批號(hào)30318)采購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH；色譜純乙腈，Dikma；色譜純甲醇，Sigma；DMSO-d6，Merck；磷酸為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1質(zhì)量守衡法計(jì)算相對(duì)純度

2.1.1酚酸類對(duì)照品色譜純度檢測(cè)

2.1.1.1液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以0.02%磷酸水溶液為流動(dòng)相A，以乙腈-0.02%磷酸水溶液8∶2為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；洗脫梯度：0～8 min,90%A→78%A,10%B→22%B;8～15 min，78%A→74%A,22%B→26%B;15～35 min,74%A→61%A,26%B→29%B;35～40 min，61%A→90%A, 39%B→10%B; 40～50 min, 90%A,10%B；流速: 1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量: 10 μl[7]。

2.1.1.2檢測(cè) 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸T/U自制對(duì)照品，每份約5 mg，精密稱定，丹參素鈉和丹酚酸B用水，其余用甲醇分別溶解并制成每1 ml含0.2 mg 對(duì)照品的溶液，即得。在280 nm下檢測(cè)，除主峰外，可見(jiàn)雜質(zhì)峰檢出，按峰面積歸一化法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2皂苷類對(duì)照品色譜純度檢測(cè)

2.1.2.1液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以水為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；洗脫梯度：0～12 min,81%A,19%B；12～60 min, 81%A→64%A,19%B→36%B；60～61 min,64%A→81%A,36%B→19%B；61～70 min,81%A,19%B;流速:1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng): 203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量: 10 μl[8]。

2.1.2.2檢測(cè) 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對(duì)照品自制對(duì)照品，每份約4 mg，精密稱定，用甲醇分別溶解制成每 1 ml含0.4 mg 的溶液，即得。在203 nm下檢測(cè)，除主峰外，可見(jiàn)雜質(zhì)峰檢出，按峰面積歸一化法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.3水分 以上9種自制對(duì)照品按照USP37-NF29<921>Ⅰa所規(guī)定的Karl-Fischer 方法進(jìn)行水分測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.4殘留溶劑 按照USP37-NF32<467>所規(guī)定方法對(duì)各對(duì)照品進(jìn)行溶劑殘留分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.5灰分 按照USP37-NF29<281>所規(guī)定方測(cè)定各對(duì)照品中的灰分，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.6質(zhì)量守衡法計(jì)算結(jié)果 相對(duì)純度=色譜純度×(1-水分含量-殘留溶劑含量-灰分含量)×100%，計(jì)算各自制對(duì)照品相對(duì)純度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 9種自制對(duì)照品相對(duì)純度結(jié)果 %

2.2核磁共振定量法計(jì)算絕對(duì)純度

2.2.1供試品溶液的制備 分別取各對(duì)照品約15 mg及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(富馬酸、馬來(lái)酸)15 mg，精密稱定，一式2份，分別用0.7 ml DMSO-d6完全溶解，振蕩搖勻，即得。

2.2.2核磁共振定量法測(cè)定結(jié)果 將供試品溶液約全部轉(zhuǎn)入5 mm核磁管中，測(cè)定。根據(jù)各對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)核磁共振譜圖，選擇定量峰進(jìn)行定量計(jì)算。絕對(duì)純度=(A樣/A內(nèi))×(n內(nèi)/n樣)×(W內(nèi)/W樣)×(M樣/M內(nèi))×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)純度×100%。計(jì)算各對(duì)照品絕對(duì)純度，其中A樣為各對(duì)照品選定信號(hào)的積分面積，A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選定信號(hào)的積分面積，n樣為各對(duì)照品被積分信號(hào)包含的質(zhì)子數(shù)，n內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)被積分信號(hào)包含的質(zhì)子數(shù)，W樣為對(duì)照品稱樣量，W內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)稱樣量，M樣為各對(duì)照品相對(duì)分子質(zhì)量，M內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果以核磁共振定量法計(jì)算丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1絕對(duì)純度(n=2)依次為99.24%、100.48%、95.12%、95.22%、94.74%、99.11%、94.66%、98.22%和95.32%。

3 討論

3.1質(zhì)量守衡法涉及對(duì)照品色譜純度、水分、殘留溶劑和灰分等諸多測(cè)定環(huán)節(jié)，核磁共振定量法測(cè)定絕對(duì)純度，不受水分、殘留溶劑和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的影響，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。9種自制對(duì)照品丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1(相對(duì)純度-絕對(duì)純度)×100%分別為：-0.90%、-0.80%、-0.16%、-0.52%、-1.25%、-5.02%、2.42%、-3.76%和-0.54%。盡管2 種方法測(cè)定原理不同，但是除了三七皂苷R1和人參皂苷Re外其余測(cè)定結(jié)果基本一致，能夠更好地相互佐證9種自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性。

3.2由于丹參素鈉中含有金屬元素Na，因此熾灼殘?jiān)鼨z查法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定化合物中所含的不燃性無(wú)機(jī)物的含量，故其灰分測(cè)定結(jié)果僅供參考，沒(méi)有計(jì)入純度計(jì)算。

3.3定量核磁技術(shù)尚未普及 ,且對(duì)于圖譜的處理及峰歸屬的判斷還不能完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化, 故 QNMR法暫時(shí)無(wú)法用于大批量樣品的分析。導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差的因素包括溶劑的選擇——樣品易溶解、能去除活潑氫干擾、與定量峰不重疊；內(nèi)標(biāo)的品質(zhì)——含量準(zhǔn)確、溶解性好、與目標(biāo)物不重疊；定量峰的選擇——與內(nèi)標(biāo)物定量峰化學(xué)環(huán)境相近、不受旁邊峰的干擾[9]。

3.4對(duì)照品定值準(zhǔn)確性是對(duì)照品的重要屬性，如何保證對(duì)照品量值準(zhǔn)確性是對(duì)照品研究的一項(xiàng)重要工作。天士力研究院在自制對(duì)照品研究中做了很多努力，也積累了很多經(jīng)驗(yàn)。本文在采用國(guó)際通用的質(zhì)量守衡法進(jìn)行賦值的同時(shí)，進(jìn)一步采用核磁共振定量法加以佐證，更好地保障了對(duì)照品的賦值準(zhǔn)確性。但是作為一項(xiàng)極其嚴(yán)格的工作，不論是質(zhì)量守恒法還是核磁共振定量法，都需要對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行持續(xù)研究并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，才能更好地保障賦值結(jié)果的可靠性。