朱軼鋒，韓順順，張克英，尹華東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)所，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130）

隨著物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對雞肉的需求已經(jīng)從數(shù)量上追求轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量上滿足。為降低肉雞規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖帶來的疫病影響，越來越密集的免疫程序以及藥物濫用導致雞肉中藥物和抗生素殘留不斷增加，動物機體耐藥性日益升高，對生態(tài)環(huán)境帶來了深層次污染，更對人類健康造成威脅。尋找安全、環(huán)保、高效的免疫調(diào)節(jié)劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物已成為畜牧業(yè)關(guān)注的熱點[1]。

近年來的大量研究證明，中藥多糖尤其是補益類多糖可提高機體免疫器官質(zhì)量，增強動物機體免疫功能，且具有安全、無毒、無殘留等優(yōu)點，是一類優(yōu)良的生物反應調(diào)節(jié)劑[2-3]。因此，采用多糖類天然產(chǎn)物來提高動物免疫能力，減少免疫次數(shù)，降低藥物殘留，越來越受到畜牧行業(yè)的重視。

黃芪是常用的扶正固本，補中益氣類中草藥。黃芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是從黃芪根部分離出的多糖物質(zhì)，為發(fā)揮其免疫增強作用的主要成分。黃芪多糖可調(diào)節(jié)動物血壓和血糖，增強機體免疫力，還具有抗病毒、抗氧化、防衰老的作用[4-5]。大量研究表明，黃芪多糖可激活機體內(nèi)淋巴細胞，引起特異性免疫應答反應，還可激活巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等免疫細胞以及誘導分泌細胞因子從而激活非特異性免疫應答反應[6-8]。

現(xiàn)代中藥藥理學研究表明，中藥對動物的免疫調(diào)節(jié)具有濃度效應，只有在最適濃度下才能發(fā)揮最佳功效，且針對不同動物機體，可表現(xiàn)出相異的促進或抑制免疫作用[9]。因此，本試驗以不同濃度的APS處理體外培養(yǎng)的雛雞外周血、胸腺、脾臟以及法氏囊淋巴細胞，通過MTT比色法檢測不同淋巴細胞體外增殖情況，以及采用ELISA和RT-qPCR分別檢測脾臟淋巴細胞中細胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6含量及其相關(guān)基因 mRNA 表達量，旨在從細胞水平和分子水平探討黃芪多糖對家禽的免疫調(diào)節(jié)機制，為其在優(yōu)質(zhì)雞生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1日齡ROSS 308肉雞，購買于四川玉冠農(nóng)業(yè)有限公司。黃芪多糖購買于某動物藥業(yè)公司，純度98.5%。采用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液溶解 APS，分別配制濃度為 20、40、80、160 以及320 μg/mL的APS溶液，微孔濾膜過濾器除菌后，4℃保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外周血、胸腺、法氏囊以及脾臟淋巴細胞的分離與制備

在7日齡選取健康雛雞6只，心臟無菌采血5 mL，肝素鈉抗凝后1∶1（V/V）加入40%percoll分層液（Pharmacia公司），再加入70%percoll分層液，3 000 r/min離心15 min，小心吸取兩層之間的白色單核淋巴細胞層吸出，Hanks液洗3次（每次1 000 r/min，離心5min）后加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（GIBCO公司），細胞濃度為2×106個/mL，采用臺盼藍染色檢測細胞存活率。

雞頸部靜脈放血致死，新潔爾滅溶液浸泡3 min，無菌取出胸腺、法氏囊和脾臟，PBS沖洗3次后剔除脂肪組織和包膜，放入裝有Hanks液的器皿中剪碎。用滅菌后的玻璃試管底部在100目的細胞篩網(wǎng)上研磨過濾，收集細胞懸液于40%percoll分層液中，再緩慢加入到70%percoll分層液之上，3 000 r/min離心15min，小心將兩側(cè)白色的單核淋巴細胞層吸出，后操作步驟同上。

1.2.2 淋巴細胞的培養(yǎng)及增殖情況測定

用96孔細胞培養(yǎng)板進行淋巴細胞的體外培養(yǎng)。將50 μL細胞培養(yǎng)液、50 μL濃度為5 μg/mL的有絲分裂原（刀豆蛋白液，ConA）以及50 μL不同濃度（20、40、80、160、320 μg/mL）APS，對照組加入 50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液（APS濃度為 0 μg/mL），每個處理設(shè)置3個重復。將混合液輕微震蕩混勻，放置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入10 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入相同量不含雞血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同時每孔添加10 mg/mL MTT溶液10 μL，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后，每孔加入100 μL DMSO，充分振蕩混勻后靜置20 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-RAD iMark）在570 nm波長處測定吸光度值（OD值）以判定細胞的增殖程度。

1.2.3 脾臟淋巴細胞中細胞因子含量的測定

脾臟淋巴細胞培養(yǎng)及處理同上，收集培養(yǎng)48 h后的細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒（上海博谷生物）測定脾臟淋巴細胞淋巴因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-β以及IFN-γ的含量，具體測定過程按試劑盒提供的說明書進行操作。根據(jù)標準品濃度及對應OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在直線回歸方程上計算出相對應的樣品濃度。

1.2.4 細胞RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測

采用RNAiso Plus（TaKaRa）試劑按照說明書提取淋巴細胞總RNA，DNaseⅠ純化處理后，1%瓊脂糖凝膠和Nanodrop ND-1000檢測RNA的完整性和濃度，隨后采用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

采用Smart Cycler II（Cepheid）實時PCR系統(tǒng)進行基因?qū)崟r定量擴增，反應總體系25 μL，包括滅菌的 ddH2O 8.5 μL，cDNA 模板 2 μL，上下游引物（表 1）各 1 μL（10 μmol/L），SYBRPremix Ex TaqTM-Ⅱ（2×）12.5 μL。采用兩步法PCR反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，2-ΔΔct法計算基因相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以均值標準誤表示，SPSS18.0軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，Duncan’s法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences of RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 APS顯著影響雞不同組織淋巴細胞體外增殖

由表1可知，與對照組相比，添加濃度為20 μg/m的APS對外周血、胸腺、法氏囊以及脾臟淋巴細胞體外增殖沒有影響（P＞0.05）。當APS濃度增加到40 μg/m以上，除胸腺外，外周血、法氏囊以及脾臟淋巴細胞各處理組OD值均顯著高于對照組（P＜0.05）。外周血淋巴細胞的OD值在160 μg/m和320 μg/m的APS處理組之間沒有差異（P＞0.05）；在法氏囊和脾臟淋巴細胞中，160 μg/m處理組的OD值顯著高于 320 μg/m處理組（P＜0.05）。80 μg/m及以上濃度APS處理顯著提高胸腺淋巴細胞OD值（P＜0.05），其中160 μg/m APS效果最佳，OD值顯著高于其他5個處理組（P＜0.05）。

2.2 APS顯著影響雞脾臟淋巴細胞因子的分泌

由表3可知，濃度為20 μg/mL的APS處理組中，脾臟淋巴細胞中分泌的Th1型細胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ 和 Th2型細胞因子 IL-4、IL-6 含量與對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05）。當APS濃度提高至40 μg/mL以上后，4個處理組中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4 和 IL-6 的含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。IL-2、IFN-γ、IL-4的含量在 APS添加濃度為160 μg/mL時達到最高水平，顯著高于其他處理組（P＜0.05），80 μg/mL的 APS處理組中，這3個細胞因子的含量也顯著高于40 μg/mL和320μg/mL處理組（P＜0.05）。TNF-β和IL-6的含量在160 μg/mL和320 μg/mL處理組間沒有差異（P＞0.05），但都顯著高于 40 μg/mL 和 80 μg/mL 處理組（P＜0.05），處理濃度為 80 μg/mL時，IL-6的含量顯著高于 40 μg/mL（P＜0.05），但 TNF-β 含量在這兩個處理之間沒有差異（P＞0.05）。

表2 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細胞增殖的影響Table 2 The effect of APS on the proliferation of lymphocyte in spleen of chicken

表3 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細胞因子含量的影響Table 3 The effect of APS on the lymphokines content in splenic lymphocytes of chicken

2.3 APS顯著影響雞脾臟淋巴細胞因子基因mRNA表達量

由表4可知，濃度為20 μg/mL的APS添加對脾臟淋巴細胞中IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表達量影響不顯著（P＞0.05）。APS濃度提高至 40 μg/mL 時，TNF-β、IFN-γ和IL-6基因mRNA顯著高于對照組（P＜0.05）。細胞中APS濃度大于超過 40 μg/mL，IL-2、TNF-β、IFN-γ、IL-4、IL-6基因mRNA表達量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中160 μg/mL效果最佳（P＜0.05）。此外，當APS濃度達到 320 μg/mL，IFN-γ、IL-4和IL-6基因 mRNA表達顯著低于80 μg/mL處理組（P＜0.05）。

2.4 APS顯著影響雞脾臟淋巴細胞表達轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達量

由表5可知，脾臟淋巴細胞中核轉(zhuǎn)錄因子TBX21和Gata-3的mRNA表達量在APS添加濃度為20 μg/mL時，與對照相比沒有顯著差異（P＞0.05）。APS濃度提高40 μg/mL后，4個處理組中TBX21和Gata-3的mRNA表達量均顯著高于對照組，其中TBX21的mRNA表達量在APS濃度為160 μg/mL的處理組中最高，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；Gata-3的mRNA表達量在160 μg/mL和320 μg/mL處理組中沒有差異（P＞0.05），但都顯著高于40 μg/mL和80 μg/mL處理組（P＜0.05）。

3 討論

淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的核心組成，是機體最重要的免疫細胞，淋巴細胞的增殖和分化是機體在免疫應答過程中最重要的階段，其增殖程度是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標[10]。近年來研究表明，APS具有促進淋巴細胞的增殖與分化，增加胞漿細胞分泌、提高血清抗體濃度、調(diào)節(jié)淋巴細胞亞群平衡等作用。王德云等[11]的研究發(fā)現(xiàn)濃度為150 μg/mL的APS協(xié)同ConA刺激雞脾臟淋巴細胞增殖的效果最好，且具有量效關(guān)系。邱妍[12]采用5個濃度的APS（50、100、200、400 以及 800 μg/mL）對雞脾臟淋巴細胞進行體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，APS可單獨或協(xié)同ConA促進淋巴細胞增殖，其中以100 μg/mL濃度最佳。章世元等[13]研究證明，一定濃度的APS能顯著促進肉仔雞脾臟和血液中B和T淋巴細胞增殖，與邱妍的報道一致，也是濃度100 μg/mL時促進效果最明顯。范云鵬等[14]報道，用APS制備的脂質(zhì)體在15.625～125 μg/mL時可單獨或與植物血凝素作用顯著提高雞B和T淋巴細胞增殖效率。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS對雞外周血、胸腺、脾臟和法氏囊中淋巴細胞增殖效率的影響同樣具有濃度效應，160 μg/mL的APS可顯著促進4個組織淋巴細胞增殖，提示在該濃度下APS可提高細胞免疫水平。

表 4 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細胞淋巴因子基因mRNA表達量的影響Table 4 The effect of APS on the mRNA expression of lymphokines gene in splenic lymphocytes of chicken

表5 黃芪多糖對雞脾臟淋巴細胞表達轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達量的影響Table 5 The effect ofAPSonthe mRNA expressionof transcriptionfactor insplenic lymphocytes ofchicken

細胞因子是由T淋巴細胞、B淋巴細胞以及NK細胞等產(chǎn)生的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白類物質(zhì)，為免疫系統(tǒng)中重要的信息分子[15]。輔助性T細胞（helper T cell，Th）對機體的特異性和非特異性免疫均具有重要的調(diào)節(jié)作用，既能促進其他T細胞的分化成熟，又能協(xié)助B細胞產(chǎn)生抗體，按照其所產(chǎn)生的細胞因子種類功能，可分為Th1和Th2型細胞，其中 Th1細胞主要分泌細胞因子 IL-2、IFN-γ、TNF-β，介導細胞免疫，誘導免疫排斥；Th2細胞主要分泌細胞因子 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，參與介導體液免疫通過抑制Th1型免疫反應從而調(diào)節(jié)免疫耐受性[16]。IL-2由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生，可促進Th0和CTL的增殖，也參與抗體反應、腫瘤監(jiān)視等，為調(diào)控免疫應答的重要因子[17]。TNF-β可增強T細胞的增殖以及抗原表達，促進IL-2、IFN-γ等淋巴因子的產(chǎn)生，并可增強有絲分裂原或外來抗原對B細胞的刺激，IFN-γ對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，增強細胞免疫功能[18]。IL-4可促使抗原或絲裂原活化的B細胞分裂增殖，刺激CD4+T細胞分化成II型輔助T細胞[19]。IL-6是由T細胞自身分泌的生長因子，其通過促進B細胞的存活而間接影響B(tài)細胞的分化[20]。王俊麗[21]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加100～400 μg/mL的APS可顯著促進肉仔雞淋巴細胞對IL-2、IL-6以及IFN-γ的分泌，證明APS可以通過調(diào)節(jié)細胞因子分泌，促進淋巴細胞增殖，進而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。趙天章等[22]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加APS可提高肉仔雞血清IL-1、IL-2和TNF-β的含量，以及42齡雞血清IL-2和TNF-β水平。陳洪亮[23]與劉永杰等[24]的試驗同時證明了APS能促進肉仔雞脾臟淋巴細胞IL-2的分泌，且與APS的添加量相關(guān)。然而，目前關(guān)于APS對雞脾臟淋巴細胞因子相關(guān)基因表達的影響研究鮮有報道。本試驗結(jié)果顯示，APS對雛雞脾臟淋巴細胞中Th1細胞因子IL-2、TNF-β、IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4和IL-6含量的影響同樣呈現(xiàn)劑量效應，濃度為160 μg/mL時對細胞因子的促分泌作用最顯著，在該濃度下，Th1和Th2型5個細胞因子的mRNA表達量也顯著高于其他處理組，說明APS可能參與雛雞細胞免疫調(diào)節(jié)。

輔助性T淋巴細胞 Th1/Th2細胞之間的相互平衡在免疫應答中起關(guān)鍵作用，是機體免疫調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)。由TBX21基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子T-bet是Th1型細胞分泌細胞因子的特異性標志，GATA-3是目前確定唯一能調(diào)控Th2型細胞因子合成的轉(zhuǎn)錄因子[25]。之前的研究已經(jīng)證明TBX21和Gata-3基因表達調(diào)控Th1/Th2細胞分化，從而影響細胞因子分泌。本研究結(jié)果顯示，APS添加可以顯著提高TBX21和Gata-3的mRNA表達量，進一步提示APS可以促進雛雞淋巴細胞分泌Th1和Th2型細胞因子，且在濃度為160 μg/mL時對這2個基因表達的促進作用最明顯。馬玉芳等[26]和鄭乃珍等[27]分別發(fā)現(xiàn)金線蓮多糖（ARP）和猴頭菇多糖（HEP）能協(xié)同ConA誘導核轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3基因表達來上調(diào)小鼠淋巴細胞Th1、Th2型細胞因子mRNA表達以及促進細胞因子分泌，進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，本研究的結(jié)果與其相似。

4 結(jié)論

APS對雛雞外周血、脾臟、胸腺以及法氏囊中的淋巴細胞體外增殖均有促進作用，APS還能上調(diào)脾臟淋巴細胞中Th1和Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3的mRNA表達，從而促進Th1細胞因子（IL-2、TNF-β和IFN-γ）以及Th2細胞因子（IL-4和IL-6）分泌，添加濃度為160 μg/mL時效果最為明顯。