王妍斌, 周 優(yōu), 林冬枝,2*, 董彥君,2*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234; 2.上海師范大學(xué) 遺傳研究所,上海 200234)

0 引 言

光合作用是影響水稻(OryzasativaL.)產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一,葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官,葉色深淺程度影響著光合作用的效率[1].葉色突變體是由葉綠素(CHL)合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因沉默或失活引起的,直接或間接影響著葉綠素的合成和降解,改變?nèi)~綠素含量.大量研究表明,葉色突變體是研究植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結(jié)構(gòu)功能、遺傳發(fā)育調(diào)控機(jī)理和農(nóng)作物標(biāo)記性狀等的理想材料[2-3].水稻葉色突變體有很多種,有一類(lèi)突變體在不同溫度條件下呈現(xiàn)出不同的葉色表型,稱(chēng)為水稻溫敏感葉色突變體,根據(jù)溫度對(duì)葉色表達(dá)的影響,將水稻溫敏感葉色突變體分為3種,即高溫表達(dá)型、低溫表達(dá)型和特殊溫敏感型[4-5].低溫表達(dá)型(水稻低溫敏感葉色)突變體是指水稻突變體的葉色表型在相對(duì)低的溫度條件下才會(huì)發(fā)生與正常葉色有差異的變化[6].目前報(bào)道有cde2[7],fan5[8],tsc1[9],tsl11[10],tcm11[6],tcm12[11],tws[12],lta1[13],1103(s)[14],ygl3[15],tsv3[16],tcd9[17],tcd5[18],tcd10[19],tcd11[20],OsGluRS[21].但其低溫誘導(dǎo)臨界溫度為20～28 ℃不等[22].高溫表達(dá)型(水稻高溫敏感葉色)突變體是指水稻突變體的葉色表型在相對(duì)高的溫度條件下會(huì)發(fā)生與正常葉色有差異的變化,與低溫條件下生長(zhǎng)的水稻葉色表型無(wú)異(如tcm5[23]).鑒于溫度對(duì)溫敏感葉色水稻突變體葉綠體發(fā)育的影響,可以利用它們探究水稻的葉綠素合成、葉綠體發(fā)育,及光合溫度響應(yīng)的分子機(jī)制.同時(shí)在水稻遺傳改良,高產(chǎn)育種中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值.

本研究通過(guò)60Coγ輻射水稻粳稻“嘉花1號(hào)”得到一個(gè)新的低溫敏感葉色突變體tcd32,對(duì)該突變體的葉色表型、光合色素含量、葉綠體顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和分析,并利用DNA分子標(biāo)記對(duì)該突變基因進(jìn)行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

所用的低溫敏感葉色突變體tcd32是用粳稻“嘉花1號(hào)”干種子,經(jīng)60Coγ射線輻照誘變所得,經(jīng)多代在上海和海南自交繁育和選種,其農(nóng)藝性狀已穩(wěn)定.

1.2 方 法

1.2.1 苗期葉色表型觀察

將突變體tcd32與野生型(WT)“嘉花1號(hào)”的種子分別在30 ℃ 條件下催芽3 d后,將發(fā)芽的種子分別播種于20,25,30 ℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型,寧波江南儀器廠)中,每天光照12 h,光照照度為180 μmol·m-2·s-1.每隔2 d觀察1次幼苗的生長(zhǎng)情況,觀察并記錄葉片的表型變化.

1.2.2 葉片光合色素含量的測(cè)定

苗期葉片中葉綠素a(CHLa),葉綠素b(CHLb)和類(lèi)胡蘿卜素(CAR)含量的提取以及測(cè)定方法參考[24].分別選取在20,25,30 ℃條件下生長(zhǎng)的突變體tcd32和野生型的三葉期幼苗的第三葉,剪取其葉片中間部分,稱(chēng)取20 mg,剪碎后放入試管中,加入5 mL葉綠素提取液(體積比為:V乙醇∶V丙酮∶V水=5∶4∶1) 于試管中,密封后,輕輕搖勻,后置于室溫暗條件下處理18～24 h,直至葉片完全褪色.用METASH-UV5100分光光度計(jì)分別測(cè)定提取液對(duì)波長(zhǎng)為470645663 nm的光的吸光度值,并分別計(jì)算出葉綠素a,葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的含量.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算其平均值.

1.2.3 葉片葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

葉片取樣方法與上述1.2.2相同,然后將葉片沿葉脈方向剪成面積約1 mm2的正方形,放入2.0 mL的離心管中,之后立即放入2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛固定液(體積比為:V25%戊二醛∶V0.2mol/L磷酸緩沖液∶

V無(wú)菌水=1∶4∶5),24 h后換新鮮的固定液,于4 ℃下保存,固定好后,進(jìn)行清洗,再固定、洗滌、脫水與硬化,再經(jīng)置換、浸漬、包埋、聚合、修塊、切片、染色等一系列處理過(guò)程后,用透射電鏡(Hitachi765型)進(jìn)行觀察拍照.

1.2.4 遺傳分析與群體構(gòu)建

利用培矮64S為母本,tcd32作為父本進(jìn)行雜交,按常規(guī)種植加代收獲的F1代和F2代種子,作為遺傳研究和基因定位的群體.

1.2.5 水稻DNA提取

用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[25]提取親本突變體tcd32和培矮64S植株的DNA,F2代中用于定位的植株群體的DNA是用簡(jiǎn)單、快速、便捷的Tris physiological saline(TPS)法[26]提取.

1.2.6 突變體基因定位

表1 用于基因定位的分子標(biāo)記

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的水稻SSR和InDel引物,檢測(cè)突變體tcd32與培矮64S間的多態(tài)性.選取在染色體均勻分布且具有多態(tài)性的5～6對(duì)引物,對(duì)20 ℃低溫下生長(zhǎng)的水稻中分離出的22個(gè)F2突變型株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,分析其帶型,確定突變基因所在染色體位置,并進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體數(shù)進(jìn)行基因定位.在目標(biāo)區(qū)域內(nèi),根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的粳稻日本晴的全基因組序列和秈稻9311的全基因組序列間的差異InDel位點(diǎn),利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),進(jìn)一步對(duì)突變基因進(jìn)行定位.實(shí)驗(yàn)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系和PCR反應(yīng)條件參照[26].PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%～3.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外線凝膠成像儀上成像,并拍照記錄.用MapMaker/exp3.0軟件構(gòu)建目的基因區(qū)域內(nèi)的遺傳圖譜.

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期突變體的表型

圖1 (a) 突變體tcd32和(b) 野生型“嘉花1號(hào)”在20,25,30 ℃條件下三葉期后生長(zhǎng)過(guò)程

觀察突變體tcd32和野生型“嘉花1號(hào)”苗期植株葉色(圖1),結(jié)果顯示:tcd32突變體在20 ℃條件下,第一,二,三,四葉片均表現(xiàn)為白化表型,植株最終枯萎死亡;在25 ℃條件下,第一,二,三葉片表現(xiàn)為黃化表型,從第四葉期開(kāi)始,葉片轉(zhuǎn)為黃綠色;但在30 ℃條件下,tcd32的植株表型與野生型沒(méi)有明顯差異.結(jié)果表明,tcd32的苗期葉色表型與生長(zhǎng)溫度密切相關(guān),具有低溫敏感葉色屬性.

2.2 突變體的光合色素含量變化

在3種不同溫度(20,25,30 ℃)條件下生長(zhǎng)的突變體tcd32和野生型“嘉花1號(hào)”幼苗的三葉期葉片的光合色素測(cè)定結(jié)果(圖2)顯示:在20 ℃條件下,tcd32的光合色素含量(包括葉綠素a、葉綠素b以及類(lèi)胡蘿卜素)與野生型相比顯著降低;在25 ℃條件下,tcd32的光合色素含量與野生型相比明顯降低;在30 ℃條件下,tcd32的光合色素含量與野生型的光合色素含量無(wú)明顯差異.此結(jié)果表明,苗期突變體光合色素含量與葉色表型相一致,具有溫敏屬性.

表2 突變體tcd32和野生型“嘉花1號(hào)”在不同溫度條件下的三葉期葉片光合色素含量

2.3 突變體葉綠體顯微結(jié)構(gòu)

對(duì)在20 ℃和30 ℃下生長(zhǎng)的突變體tcd32和野生型“嘉花1號(hào)”三葉期的第3葉中的葉綠體的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察(圖3),發(fā)現(xiàn)野生型“嘉花1號(hào)” 的葉綠體在高溫和低溫下都發(fā)育正常;而突變體tcd32在20 ℃下幾乎觀察不到一個(gè)完整的葉綠體結(jié)構(gòu),而在30 ℃下,突變體tcd32中的葉綠體又恢復(fù)正常發(fā)育,具有完整清晰的內(nèi)囊體片層結(jié)構(gòu),與野生型相一致.這說(shuō)明在低溫條件下該突變體tcd32的葉綠體發(fā)育分化受到嚴(yán)重影響,光合色素合成受阻,不能進(jìn)行正常光合作用,進(jìn)而產(chǎn)生突變表型.

圖3 野生型“嘉花1號(hào)”和突變體tcd32植株在不同溫度條件下的葉綠體顯微結(jié)構(gòu).(a) 突變體tcd32,20 ℃;(b) 突變體tcd32,30 ℃;(c) WT,20 ℃;(d) WT,30 ℃

2.4 遺傳分析

2.5 基因定位

從F2代突變型白化苗中,選取22株進(jìn)行連鎖分析,發(fā)現(xiàn)水稻第3號(hào)染色體上的分子標(biāo)記RM14359有強(qiáng)烈的偏態(tài)擴(kuò)增,如圖4(a)所示,表明tcd32位于第3染色體上,然后擴(kuò)大F2群體至288株,將該基因tcd32定位在RM14359的上游,與其遺傳距離為9.2 cM,如圖4(b)所示,然后在RM14359的上游設(shè)計(jì)新的4個(gè)分子標(biāo)記(ID1,ID2,RM14282,RM3203),將定位群體擴(kuò)大至2887株,發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記ID1和ID2均與突變基因tcd32表現(xiàn)共分離,而RM14282與tcd32基因的遺傳距離為1.3 cM,最終將tcd32基因鎖定在RM14282的上游的染色體頂端的537 kb內(nèi).

圖4 突變體在分子標(biāo)記RM14359的(a) 電泳圖和(b) 遺傳定位圖

3 討 論

水稻是禾本科和單子葉植物的模式植物.隨著水稻基因組測(cè)序的完成,水稻的功能基因組學(xué)受到越來(lái)越多的關(guān)注[28].其中,葉色突變體是研究葉綠體發(fā)育與功能以及葉綠素代謝的理想材料.就不完全統(tǒng)計(jì),缺乏葉綠素導(dǎo)致水稻葉色發(fā)生改變的突變體至少有297個(gè),其中已定位到染色體上的突變基因有163個(gè),在水稻12條染色體上均有分布.其中,第1,3,5,6,11染色體上居多,尤其第3染色體上多達(dá)38個(gè),而在第12染色體上發(fā)現(xiàn)最少時(shí)只有4個(gè)[5,29-31].但在這些葉色突變體中,表現(xiàn)溫敏感的也有67個(gè),其中低溫敏感型56個(gè),高溫敏感型9個(gè),特殊溫敏感型2個(gè)[5,29-30].分布在第1,3,4,9,11染色體上較多,在第3染色體上有13個(gè),其中低溫敏感型有12個(gè),高溫敏感型有1個(gè)(ST1[32]).而目前被克隆的低溫敏感型的葉色基因有:V1,V2,TCD5,TCD9,TCD10,TCD11.其中:V1基因編碼一個(gè)葉綠體蛋白NUS1[33];V2基因編碼一個(gè)調(diào)節(jié)葉綠體翻譯的新型鳥(niǎo)苷酸激酶(pt/mt GK)[34];TCD5基因編碼單加氧酶蛋白[18];TCD9基因編碼分子伴侶蛋白Cpn60α[17];TCD10編碼一個(gè)PPR蛋白[19];TCD11編碼核糖體S6蛋白[20],這些基因在低溫條件下對(duì)質(zhì)體編碼基因的轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致低溫條件下早期葉綠體發(fā)育異常.這表明水稻早期葉綠體發(fā)育過(guò)程中存在多種低溫響應(yīng)的分子機(jī)制.另外,突變體tcd32表型與v1,v2,tcd5,tcd9,tcd10,tcd11類(lèi)似,均表現(xiàn)為低溫敏感,即在低溫條件下葉片表現(xiàn)為黃化或白化,但在持續(xù)低溫條件下突變體tcd32死亡.在本研究中,將tcd32基因定位在第3染色體的頂端上的537 kb區(qū)間內(nèi),該區(qū)域包含89個(gè)候選基因,預(yù)測(cè)其中23個(gè)可能與葉綠體發(fā)育或葉綠素的合成相關(guān),目前尚未被報(bào)道和克隆.今后,將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)擴(kuò)大定位群體,在染色體頂端設(shè)計(jì)更多新的分子標(biāo)記.進(jìn)一步對(duì)該突變體進(jìn)行圖位克隆和功能分析,將有助于進(jìn)一步了解水稻葉綠體發(fā)育分子作用機(jī)理.