趙瑜 尹利輝 胡昌勤

[摘要] 目的 應(yīng)用拉曼光譜法建立定性鑒別模型，實(shí)現(xiàn)紫杉醇脂質(zhì)體制劑的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。 方法 隔包裝采集注射用紫杉醇脂質(zhì)體的拉曼光譜，使用主成分分析（PCA）算法去除包裝的干擾信號(hào)，提取紫杉醇脂質(zhì)體的拉曼信號(hào)，用經(jīng)典最小二乘（CLS）建立定性鑒別模型。對(duì)模型進(jìn)行正向驗(yàn)證和反向驗(yàn)證確定判別的閾值，模型輸出的相關(guān)系數(shù)值同閾值比較進(jìn)行定性判定。使用外標(biāo)法實(shí)現(xiàn)方法在三種儀器上的轉(zhuǎn)移。 結(jié)果 排除玻璃包裝的干擾提取的光譜與直接測(cè)量的光譜相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9744，建立的紫杉醇脂質(zhì)體定性模型，判斷閾值為0.85，正向驗(yàn)證（脂質(zhì)體制劑）和反向驗(yàn)證（脂質(zhì)體膜成分和紫杉醇）結(jié)果均為通過。通過使用傳遞光譜和峰位檢索，方法能夠在便攜式拉曼光譜儀、傅里葉拉曼光譜儀和顯微成像拉曼光譜儀上實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。 結(jié)論 本研究所建立的快速篩查方法可滿足抗癌類貴重藥品的現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室快速篩查，為監(jiān)管和公安打假提供一種科學(xué)有效的手段。

[關(guān)鍵詞] 拉曼光譜法；經(jīng)典最小二乘算法；紫杉醇脂質(zhì)體；假冒藥品

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）07（a）-0024-06

Application of Raman spectroscopy on the rapid screening of paclitaxel liposome preparation

ZHAO Yu YIN Lihui HU Changqin

Institute for Chemical Drug Control， National Institutes of Food and Drug Control，Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To realize the rapid screening on site， Raman spectroscopy was applied to establish an identification model of paclitaxel liposome preparation. Methods Raman spectra of the whole paclitaxel liposome product with package were first collected， and principal component analysis（PCA） algorithm was then used to extract paclitaxelliposome signals from the identified signals. Classic least squares（CLS） algorithm was used to established the identification model. The threshold was determined by the positive validation and negative challenge tests， and identification results would be get by compare the the correlation coefficients with the threshold. External standard method was utilized to realize the model transfer on three different kinds of Raman spectrometer. Results The correlation coefficient between the extracted spectrum and directly-measured spectrum was 0.9744. The paclitaxelliposome identification model was built with a threshold of 0.85， and results of both positive validation and negative challenge tests were all passed. Model transfer results also indicated that with the use of transfer spectra and peak search， the method established could be used on portable Raman， microscope imaging Raman and FT-Raman spectroscopes. Conclusion The Raman method established in this study could realize expensive anticarcinogen both on-site non-invasively and laboratory use， which can provide a scientific and efficient means for regulation and crackdown on counterfeit expensive medicine.

[Key words] Raman spectroscopy； Classic least squares algorithm； Paclitaxel liposome； Counterfeit medicines

公安機(jī)關(guān)公布的假藥案件中，假冒抗癌類藥物日漸猖獗?？拱┧幬飪r(jià)格昂貴，近年來在亞洲和中東地區(qū)出現(xiàn)的假冒抗癌藥物的數(shù)量呈上升趨勢(shì)，國(guó)際藥物安全研究所2016年公布的數(shù)據(jù)顯示，抗癌藥制假造假的增長(zhǎng)率為29%，高居第四位[1]。

紫杉醇為天然提取或半合成制備的化學(xué)抗腫瘤藥，在水中幾乎不溶，在甲醇、乙醇、三氯甲烷中溶解[2]。紫杉醇注射液配方中用高濃度的乙醇作為助溶劑，因此需要特殊的輸液裝置，用很低的滴注速度。由于注射后患者極易出現(xiàn)過敏反應(yīng)，因此給藥時(shí)為防止發(fā)生嚴(yán)重過敏反應(yīng)常使用地塞米松、抗組胺藥或H2受體拮抗劑等同時(shí)進(jìn)行預(yù)防給藥，使紫杉醇在臨床上的應(yīng)用受到了很大程度的限制。紫杉醇脂質(zhì)體是將紫杉醇包裹在磷脂膜材料中，使藥物具有靶向性，避免了高濃度乙醇對(duì)患者注射的刺激性，明顯降低紫杉醇的過敏反應(yīng)、毒性，在臨床使用上具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。紫杉醇脂質(zhì)體制劑的價(jià)格昂貴，進(jìn)口產(chǎn)品要上萬元1支，南京綠葉思科藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的力撲素（注射用紫杉醇脂質(zhì)體）售價(jià)也在千元左右，是名副其實(shí)的貴重藥品。

中國(guó)藥典2015版收錄拉曼方法為藥典方法[4]。使用拉曼光譜法定性鑒別的傳統(tǒng)方式為采集純物質(zhì)光譜，與對(duì)照品的拉曼光譜或標(biāo)準(zhǔn)譜圖集比對(duì)的方法。但對(duì)于藥物制劑，除了無輔料的注射用粉針和配方單一的注射液外[5]，樣品通常為混合物，采集的制劑拉曼光譜很難直接通過比對(duì)的方法進(jìn)行定性鑒別。而使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以對(duì)混合信號(hào)進(jìn)行分離[6]，通過計(jì)算的輸出值同閾值比較，給出定性結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)制劑的鑒別甚至是無損檢測(cè)[7-8]。本研究開展紫杉醇固體脂質(zhì)體制劑的拉曼光譜定性方法研究，使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立固體脂質(zhì)體制劑的快速篩查方法，并進(jìn)一步進(jìn)行模型轉(zhuǎn)移研究，提高方法的實(shí)用性和適用性，為打擊假冒貴重抗癌藥品提供一種科學(xué)有效的監(jiān)管手段。

1 材料與方法

1.1 材料

Metage OPAL-3000型便攜式拉曼光譜儀（Metage Scientific， Banbury，UK），采用光纖測(cè)量方式，探頭焦距5 mm，激發(fā)光源785 nm，分辨率4.5 cm-1，光譜范圍200～3000 cm-1，CCD檢測(cè)器，工作溫度-50℃。特殊設(shè)計(jì)樣品倉(cāng)，可同時(shí)確保不同包裝的液體注射劑測(cè)量時(shí)處于探頭的焦點(diǎn)和完全避光環(huán)境。軟件RFDI2015 （version 3.00），用于光譜的采集和模型的建立。

方法轉(zhuǎn)移驗(yàn)證用儀器：Bruker E55-FRA型傅里葉拉曼光譜儀，激發(fā)光源1064 nm，分辨率0.5 cm-1，光譜范圍50～3500 cm-1；Thermo DXR-image型顯微成像拉曼光譜儀，激發(fā)波長(zhǎng)785nm，分辨率4 cm-1，光譜范圍50～3300 cm-1。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：紫杉醇對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100382-201102；磷脂酰膽堿，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190064-201301；大豆磷脂酰膽堿，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)190002-201603；蛋黃磷脂酰膽堿，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190005-201602；鞘磷脂，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：190023-201603；膽固醇，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111618-200301。

紫杉醇脂質(zhì)體制劑樣品：注射用紫杉醇脂質(zhì)體，南京綠葉制藥有限公司，30 mg，批號(hào)：216090209。

1.2 方法

1.2.1 處方研究 根據(jù)產(chǎn)品說明書，力撲素脂質(zhì)體組成包括：紫杉醇、卵磷脂、膽固醇、蘇氨酸、葡萄糖，其中卵磷脂和膽固醇是脂質(zhì)體膜的組成部分。膽固醇的作用是增加脂質(zhì)體膜的剛性[9]，一般添加量占30%左右；卵磷脂的主要成分是磷脂酰膽堿。除磷脂酰膽堿，本研究還對(duì)大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿、鞘磷脂等其他脂質(zhì)體輔料進(jìn)行了研究，并作為反向挑戰(zhàn)樣品對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 拉曼光譜采集 拉曼光譜儀測(cè)樣前需校正（基線偏移量、x軸準(zhǔn)確度、y軸準(zhǔn)確度）及自檢[10]，自檢性能指標(biāo)通過才能進(jìn)行樣品拉曼光譜的采集。便攜式拉曼光譜測(cè)試條件：分辨率4.5 cm-1，光譜范圍200～3000 cm-1，積分時(shí)間5 s，累加次數(shù)10次，激光輸出功率為100 mW；傅里葉拉曼光譜儀測(cè)試條件：分辨率4 cm-1，光譜范圍50～3500 cm-1，積分時(shí)間60 s，累加次數(shù)10次，激光輸出功率為50 mW；顯微成像拉曼光譜儀測(cè)試條件：分辨率4 cm-1，光譜范圍50～3300 cm-1，20倍物鏡，積分時(shí)間5 s，累加4次，激光輸出功率20 mW。

1.2.3 模型建立 譜圖預(yù)處理方法采用一階導(dǎo)數(shù)，25點(diǎn)平滑。使用紫杉醇對(duì)照品、脂質(zhì)體輔料對(duì)照品的拉曼光譜作為目標(biāo)光譜，使用PCA提取的多種玻璃主成分光譜作為干擾光譜，按照CLS（經(jīng)典最小二乘）原理建立定性鑒別模型。將從隔包裝測(cè)量的拉曼光譜（紫杉醇脂質(zhì)體和玻璃的混合拉曼信號(hào)）中提取紫杉醇脂質(zhì)體信號(hào)，與目標(biāo)光譜比較，進(jìn)行定性鑒別。具體做法為通過模型計(jì)算擬合出樣品中紫杉醇脂質(zhì)體的光譜圖，計(jì)算其與紫杉醇與脂質(zhì)體輔料的加和標(biāo)準(zhǔn)光譜的相關(guān)系數(shù)R，作為定性判別的指標(biāo)。用收集的紫杉醇脂質(zhì)體樣品作為正向驗(yàn)證，用紫杉醇對(duì)照品、空白脂質(zhì)體組成輔料以及其他脂質(zhì)體輔料作為反向驗(yàn)證，用于閾值的確定和模型驗(yàn)證。如果相關(guān)系數(shù)大于閾值則定性結(jié)果為“是”，否則為“否”。

1.2.4 方法轉(zhuǎn)移 對(duì)便攜式拉曼光譜儀、顯微成像拉曼光譜儀以及傅里葉拉曼光譜儀都使用從包裝中取出制樣的方法進(jìn)行測(cè)量。使用泰諾林作為標(biāo)準(zhǔn)固體樣品[11]，采用外標(biāo)法，分別在便攜式拉曼光譜儀、傅里葉拉曼光譜儀、顯微成像拉曼光譜儀上采集拉曼光譜，以便攜式拉曼光譜儀的光譜為基準(zhǔn)，計(jì)算后兩者的傳遞光譜作為輸入模型計(jì)算的光譜[12]。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體膜成分的拉曼光譜

注射用紫杉醇脂質(zhì)體樣品裝量約為1.17 g，根據(jù)紫杉醇標(biāo)示量30 mg，則紫杉醇含量約為2.6%（w/w），說明脂質(zhì)體制劑的主要組成部分是脂質(zhì)體膜的組成物質(zhì)：卵磷脂和膽固醇。膽固醇的拉曼光譜2933、2268、1672、1439、700 cm-1處有強(qiáng)的特征峰（圖1A）。卵磷脂的拉曼光譜在2885、2851、1737、1659、1440、1298、1093、1064、712 cm-1處有較強(qiáng)特征峰（圖1B）。

磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿的拉曼光譜特征峰基本一致，僅在1000～1100 cm-1處峰存在差異（圖1B、圖2A～B）。鞘磷脂的拉曼光譜與卵磷脂的拉曼光譜差異明顯，如2700～3000 cm-1、1600～1700 cm-1以及1000～1200 cm-1范圍內(nèi)均存在差異（圖2C）。

2.2 無損測(cè)量信號(hào)提取

本文對(duì)采集的注射用紫杉醇脂質(zhì)體樣品隔瓶測(cè)量的拉曼光譜，一階導(dǎo)數(shù)光譜預(yù)處理，使用PCA-CLS方法擬合，消除玻璃包裝的干擾，提取得到的紫杉醇脂質(zhì)體拉曼光譜（圖3A），峰位清晰，與直接測(cè)量的紫杉醇脂質(zhì)體光譜（圖3B）在500～2000 cm-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9744。

2.3 紫杉醇脂質(zhì)體定性模型

對(duì)比紫杉醇脂質(zhì)體、紫杉醇、空白脂質(zhì)體（膽固醇和磷脂酰膽堿）的拉曼峰位（圖4），紫杉醇脂質(zhì)體的拉曼光譜中僅有1123 cm-1處峰無干擾，為紫杉醇特征峰，其余峰位處紫杉醇的特征峰和空白脂質(zhì)體（膽固醇和磷脂酰膽堿）的特征峰多有重疊現(xiàn)象，因此無法使用傳統(tǒng)的譜圖對(duì)照法對(duì)紫杉醇和脂質(zhì)體的特征峰一一比對(duì)實(shí)現(xiàn)定性鑒別。

因此，本研究使用CLS算法，將脂質(zhì)體制劑中的紫杉醇、卵磷脂和膽固醇作為參考目標(biāo)光譜，建立注射用紫杉醇脂質(zhì)體的無損定性鑒別模型，其中，計(jì)算譜區(qū)600～1200 cm-1很好的利用了三者的指紋圖譜，大大提高了模型的辨識(shí)度；根據(jù)經(jīng)驗(yàn)初步設(shè)定閾值為0.85，此閾值可根據(jù)模型驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

2.4 模型的驗(yàn)證

使用注射用紫杉醇脂質(zhì)體樣品作為正向驗(yàn)證、脂質(zhì)體組成成分（磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、蛋黃磷脂酰膽堿、鞘磷脂、膽固醇）和紫杉醇作為反向驗(yàn)證，對(duì)定性鑒別模型進(jìn)行驗(yàn)證，模型輸出的相關(guān)系數(shù)R值見表1。0.85作為定性判別的閾值，能區(qū)分正向驗(yàn)證和反向驗(yàn)證的樣品，得到正確的鑒別結(jié)果。

2.5 方法轉(zhuǎn)移

便攜式拉曼光譜儀、顯微成像拉曼光譜儀以及傅里葉拉曼光譜儀的測(cè)量的拉曼光譜特征峰位基本一致（圖5），但相對(duì)峰強(qiáng)度存在差異。光譜直接代入紫杉醇脂質(zhì)體模型，輸出值分別為0.9043（圖5A）、0.7997（圖5B）和0.8531（圖5C），顯然顯微成像拉曼光譜（圖5B）的結(jié)果超出了模型的判斷閾值，無法得到有效的判斷。使用計(jì)算的傳遞光譜代入紫杉醇脂質(zhì)體模型，輸出值分別為0.9393（圖5A）、0.8832（圖5B）和0.9025（圖5C），使用閾值0.85可以實(shí)現(xiàn)有效的定性鑒別，有效的提高了定性判別的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了方法的轉(zhuǎn)移。

3 討論

磷脂酰膽堿、卵磷脂、大豆磷脂酰膽堿和蛋黃磷脂酰膽堿都是制備脂質(zhì)體常用的磷脂材料，其主要區(qū)別在于來源不同、磷脂酰膽堿的含量不同：卵磷脂是由其他磷脂提純獲得的顆粒及粉末，磷脂酰膽堿含量可達(dá)95%以上；大豆磷脂酰膽堿取自大豆壓榨豆油以后的豆渣和豆餅，磷脂酰膽堿含量約占22%；蛋黃卵磷脂取自動(dòng)物胚胎或雞蛋蛋黃，磷脂酰膽堿含量約占73%[13]。鞘磷脂也是一種常用的脂質(zhì)體輔料，它是一種由神經(jīng)酰胺的C-1羥基上連接了磷酸膽堿（或磷酸乙醇胺）構(gòu)成的鞘脂，鞘磷脂是動(dòng)物細(xì)胞膜及其他各種生物膜的主要組成部分，其取之于高等動(dòng)物，如人血漿中就含有豐富的鞘磷脂[13]。由此可見，各種磷脂不僅在結(jié)構(gòu)上相似，而且成分亦有重疊，本研究考察了它們光譜上的異同程度；同時(shí)將4種磷脂材料作為定性鑒別反向驗(yàn)證的挑戰(zhàn)樣品，一方面確定了判定閾值，另一方面驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性。

本文所建的定性模型是基于長(zhǎng)焦距光纖探頭配置的便攜式拉曼光譜儀建立的無損檢測(cè)方法，使用時(shí)可隔玻璃包裝采集拉曼光譜，有效的鑒別紫杉醇脂質(zhì)體。顯微成像拉曼和傅里葉拉曼受聚焦模式的限制，無法實(shí)現(xiàn)隔包裝的有效測(cè)量，需取樣品制樣后測(cè)量。值得注意的是，本文所建模型對(duì)從包裝中取出樣品進(jìn)行測(cè)量的方式同樣適用，而無需更改模型參數(shù)。這是因?yàn)槟Ｐ偷膶?duì)干擾光譜的計(jì)算采用過濾的方式，當(dāng)沒有玻璃信號(hào)干擾時(shí)，計(jì)算得到的玻璃貢獻(xiàn)的權(quán)重值為很小，接近于零。

不同原理的拉曼光譜儀，使用的硬件（如激光器、聚焦系統(tǒng)、分光系統(tǒng)、檢測(cè)器等）不同，儀器原理和硬件上的差異會(huì)引起固體樣品的散射信號(hào)中物理信號(hào)的差異，反映在拉曼光譜上即相對(duì)峰強(qiáng)度的差異。這些差異在使用快速篩查方法進(jìn)行計(jì)算時(shí)會(huì)影響輸出的相關(guān)系數(shù)值，進(jìn)而影響方法的準(zhǔn)確性。因此對(duì)于便攜式拉曼光譜儀、顯微成像拉曼光譜儀和傅里葉拉曼光譜儀，相對(duì)峰強(qiáng)度的統(tǒng)一是實(shí)現(xiàn)方法轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。本研究通過方法轉(zhuǎn)移，使建立的快速篩查方法具有更廣泛的適用性，增加了方法的應(yīng)用范圍，可滿足不同情況的監(jiān)管需求。

綜上所述，本文所建立的拉曼光譜方法能夠?qū)崿F(xiàn)紫杉醇固體脂質(zhì)體制劑的快速篩查，方法對(duì)注射用紫杉醇脂質(zhì)體進(jìn)行的定性鑒別直接輸出判定結(jié)果，而無需譜圖解析，對(duì)使用人員要求低，實(shí)用性強(qiáng)。使用長(zhǎng)焦距光纖探頭的便攜式拉曼光譜儀可直接用于抗癌類貴重藥品的隔包裝檢測(cè)，簡(jiǎn)單快速，結(jié)果可靠，尤其適合貴重藥品和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。方法亦可轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室用多種拉曼光譜儀上使用，實(shí)現(xiàn)定性鑒別。因此，本文所建的方法為一種通用的紫杉醇脂質(zhì)體制劑快速篩查手段，具有廣泛的適用性和較高的實(shí)用性，能為抗癌類貴重藥品的監(jiān)管和公安打假提供一種簡(jiǎn)便、可行、科學(xué)的方法。

志謝：感謝江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院范青峰主任為本研究提供樣品。

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（收稿日期：2018-01-25 本文編輯：李岳澤）