涂志蘭，葉 敏，王志娥，金芃芃，王清華，葉 軍，宿 映，楊化蘭，李清華，肖偉忠，侯雙興#

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 201399； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院普外科，上海 201399； 3.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，上海 201399； 4.復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院科創(chuàng)中心，上海 201399)

腦卒中是全球人口死亡和殘疾的主要原因，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜[1]，而缺血性腦卒中為其最常見(jiàn)的類型，約占全部腦卒中的87%[2]。紅景天苷是紅景天根和根莖中的主要活性成分，具有抗疲勞、抗炎、抗自由基損傷、抗細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)免疫功能等多種藥理作用[3]。最新研究結(jié)果表明，紅景天苷可改善內(nèi)皮損傷，減輕動(dòng)脈硬化程度，對(duì)急性腦缺血損傷具有顯著的神經(jīng)保護(hù)功能，而體外研究結(jié)果顯示紅景天具有很強(qiáng)的抗氧化活性[4-5]。但目前紅景天苷對(duì)急性缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚。熱休克蛋白(HSP)是在高熱、缺氧等應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，其中與急性缺血性腦卒中關(guān)系最為密切的是HSP70，其在缺血缺氧應(yīng)激后表達(dá)程度最高。本研究通過(guò)將紅景天苷預(yù)處理后進(jìn)行大鼠大腦動(dòng)脈自體血栓栓塞，建立急性缺血性腦卒中模型，觀察大鼠腦組織及動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量的變化，以探討紅景天苷預(yù)處理后HSP70在急性缺血性腦損傷中腦組織及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的差異。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠24只，體質(zhì)量300～400 g，鼠齡12～13個(gè)月，雄性為主，由上海市浦東醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。

1.2 試驗(yàn)用具

不同型號(hào)的PE管，長(zhǎng)約4 cm，包括：內(nèi)徑×外徑=1.0 mm×0.5 mm，內(nèi)徑×外徑=0.50 mm×0.25 mm，內(nèi)徑×外徑=0.61 mm×0.28 mm；22G寵物專用輸液留置針；不同型號(hào)注射器(1 ml、5 ml)若干。

2 方法

2.1 分組

將SD大鼠24只隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、自體血栓栓塞組(Z組)及自體血栓栓塞+紅景天苷組(HZ組)，每組8只。

2.2 紅景天苷預(yù)處理

紅景天苷臨用前以雙蒸水溶解為5 g/L(平均1 ml中含紅景天苷5 mg)。HZ組大鼠腹腔注射紅景天苷24 mg/(kg·d)，連續(xù)注射6 d；C組、Z組大鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射6 d。第7日取Z組、HZ組大鼠制作大腦中動(dòng)脈自體血栓栓塞模型。

2.3 大鼠大腦中動(dòng)脈自體血栓栓塞模型的建立

(1)血栓制作過(guò)程：取Z組、HZ組大鼠，腹腔內(nèi)注射0.4%戊巴比妥10 ml/kg，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，保持室內(nèi)溫度20～25 ℃。術(shù)中注意動(dòng)物呼吸并保持呼吸道通暢，左側(cè)頸正中切口，尋找頸總動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎，結(jié)扎線提起頸總動(dòng)脈，將1 ml針筒的末端連接4 cm的PE管，用眼科剪將頸總動(dòng)脈剪一小口，將1 ml針筒的末端連接4 cm的PE管(規(guī)格：內(nèi)徑*外徑=1.0 mm*0.5 mm，北京西濃科技有限公司)導(dǎo)流出動(dòng)脈血，使4 cm的PE管內(nèi)充滿動(dòng)脈血(約0.2 ml)后結(jié)扎線上提阻斷血液，將內(nèi)有動(dòng)脈血的PE管放置于40～60 ℃左右的水面上靜置30～40 min，然后將導(dǎo)管內(nèi)的血凝塊用注射器緩緩移入0.9%氯化鈉溶液中，清洗2～3遍去掉血栓表面的紅細(xì)胞。(2)大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型的制作：用4 cm的PE管設(shè)計(jì)留置導(dǎo)管：將22G寵物專用輸液留置針末端連接至總長(zhǎng)4 cm的PE管(規(guī)格：內(nèi)徑×外徑=0.50 mm×0.25 mm，北京西濃科技有限公司)上，PE管末端2 cm處進(jìn)行標(biāo)記，用該設(shè)計(jì)的留置導(dǎo)管吸取上述凝縮后約2 cm的血栓，在該頸總動(dòng)脈開(kāi)口前，后各放1根手術(shù)線，打活結(jié)，將該設(shè)計(jì)的留置導(dǎo)管在剪開(kāi)的頸總動(dòng)脈剪開(kāi)的開(kāi)口處插入，插入后1根結(jié)扎線系緊，尋找頸內(nèi)動(dòng)脈后，沿頸內(nèi)動(dòng)脈方向，利用眼科鑷將該P(yáng)E管緩慢輕推帶有血栓的PE管至遇輕微阻力后阻塞大腦中動(dòng)脈起始處，松開(kāi)另1根結(jié)扎線，緩緩將PE管內(nèi)的血栓注入大腦中動(dòng)脈后將PE管緩慢推出后立即將開(kāi)口處用結(jié)扎法扎緊，進(jìn)行縫合，縫好后用酒精棉球消毒皮膚縫合處。術(shù)中及麻醉期間以小電熱毯維持大鼠直腸溫度36.5～37 ℃，注意觀察大鼠呼吸及心率變化。建模成功表現(xiàn)為：大鼠左前肢持續(xù)屈曲，提尾實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；側(cè)推抵抗力減弱，轉(zhuǎn)圈試驗(yàn)陽(yáng)性。

2.4 建模2 h后操作

2.4.1 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測(cè)腦梗死體積：Z組、HZ組大鼠按“2.3”項(xiàng)下方法栓塞2 h后處死大鼠，斷頭取腦后以視交叉為中心，取厚腦片2 mm，放入液氮中冷凍2 min后取出，放入2%的TTC溶液中，置于37 ℃溫水浴30 min染色，正常組織染為紅色，梗死組織呈白色。然后將腦片放入4%多聚甲醛中固定，1 d后測(cè)梗死體積以排除梗死組織不同程度水腫的影響。采用Image ProPlus 6.0圖像分析軟件測(cè)出各層梗死面積、總面積之和，計(jì)算公式為腦梗死體積比例=(各切面梗死面積之和)/(各切面面積之和)[6]。

2.4.2 檢測(cè)HSP70蛋白的表達(dá)：Z組、HZ組大鼠建模2 h后留取動(dòng)脈血，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HSP70蛋白的表達(dá)。

2.4.3 腦組織及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP70的表達(dá)量：Z組、HZ組大鼠斷頭取腦后，取左側(cè)腦組織，采用Western Blot法檢測(cè)HSP70在腦組織中的表達(dá)。同時(shí)在左側(cè)大腦皮層獲取腦組織內(nèi)微血管，收集腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分層，采用Western Blot法檢測(cè)HSP70在血管內(nèi)皮細(xì)胞中蛋白表達(dá)，提取大鼠腦組織總蛋白，計(jì)算蛋白含量。安裝垂直電泳儀，配置10%的SDS分離膠及濃縮膠。取樣本變性、冰浴，離心后上樣。電泳后組裝濕式轉(zhuǎn)印夾層，恒壓轉(zhuǎn)移蛋白1.5 h，取出轉(zhuǎn)印膜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶定位目的基因，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉室溫(25 ℃)1 h，一抗4度孵育過(guò)夜、二抗室溫1 h孵育，顯影觀察，應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行條帶的灰度測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 三組大鼠TTC染色結(jié)果比較

與C組比較，Z組大鼠的腦梗死面積極明顯增大，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HZ組大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而HZ組與Z組大鼠腦梗死體積的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1—2。提示模型成功，紅景天苷預(yù)處理對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈自體血栓栓塞模型的腦缺血損傷有減輕作用。

圖1 TTC染色結(jié)果Fig 1 Staining results of TTC

3.2 三組大鼠動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量比較

與C組比較，Z組大鼠動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量明顯增多，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而HZ組大鼠動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量極明顯增多，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與Z組相比，HZ組大鼠動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。表明Z組、HZ組大鼠不同程度的應(yīng)激導(dǎo)致了動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量的增加。

圖2 三組大鼠切面梗死面積與切面面積的比Fig 2 Ratio of the infarcted area to the cut area among three groups of rats

圖3 三組大鼠動(dòng)脈血HSP70表達(dá)量比較Fig 3 Comparison of HSP70 expression in arterial blood among three groups of rats

3.3 Western Blot法檢測(cè)三組大鼠腦組織與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP70表達(dá)量變化情況

與Z組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP70表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4—5。

圖4 三組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達(dá)量Fig 4 Expression of HSP70 in brain tissue of autologous thromboembolism among three groups of rats

圖5 三組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP70表達(dá)量Fig 5 Expression of HSP70 in lateral cerebral microvascular endothelial cells of autologous thromboembolismamong three groups of rats

4 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，在高原上生存的生物中，有的依靠增加血紅蛋白水平來(lái)適應(yīng)低氧環(huán)境，還有的通過(guò)改善血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能增加對(duì)氧的親和度[7]。紅景天素有“高原人參”之稱，著名藏醫(yī)經(jīng)典《四部醫(yī)典》中記載紅景天藥理作用廣泛，其具有增強(qiáng)心腦耐缺氧、抗炎等的作用，還可抗疲勞、抗寒冷、提高免疫功能、抑制缺血再灌注損傷引起的脂質(zhì)過(guò)氧化及清除自由基等[8]。研究結(jié)果提示，紅景天苷可通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/缺氧誘導(dǎo)因子(PI3K/Akt/HIF)信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦缺血性損傷；并可通過(guò)延長(zhǎng)腦卒中的治療時(shí)間窗而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；雖然目前紅景天苷的神經(jīng)保護(hù)作用已被廣泛報(bào)道，但其具體作用機(jī)制、由何種相關(guān)蛋白參與及主要通過(guò)何種通路發(fā)揮作用尚不清楚[9]。

多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均提示，HSP70作為最重要的內(nèi)源性熱休克蛋白，在減輕應(yīng)激損傷、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、恢復(fù)細(xì)胞功能及減輕炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的作用[10-12]。研究結(jié)果顯示，HSP70對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死有抑制作用[13]，但HSP70應(yīng)激性表達(dá)增加能否拮抗神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激及其分子機(jī)制目前尚無(wú)直接的研究報(bào)道，如能發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的化合物，其在臨床治療上將有廣闊的應(yīng)用前景。

前期研究中，通過(guò)對(duì)由高脂血癥引起的兔顱內(nèi)外不同腦動(dòng)脈硬化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，相同實(shí)驗(yàn)條件下，顱內(nèi)動(dòng)脈硬化程度比顱外動(dòng)脈硬化程度輕[14]；通過(guò)對(duì)顱內(nèi)外不同硬化動(dòng)脈進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了8種差異蛋白表達(dá)，對(duì)其中的HSP70進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其在顱內(nèi)動(dòng)脈表達(dá)量高于顱外動(dòng)脈，推測(cè)動(dòng)脈硬化程度可能與HSP70的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)[15]，但未進(jìn)行深入探討。目前，西方醫(yī)學(xué)尚無(wú)確切的治療手段針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。一些中藥制劑對(duì)延緩動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)展具有確切的療效，但具體作用機(jī)制尚不明確。挖掘中藥中具有誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)的有效成分并闡明其分子作用機(jī)制，可為開(kāi)發(fā)治療腦缺血的新藥提供理論基礎(chǔ)[13]。本研究結(jié)果顯示，與Z組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦組織HSP70表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，HZ組大鼠自體血栓栓塞側(cè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP70表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示紅景天苷可有效誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。

本研究首先檢驗(yàn)了紅景天苷預(yù)處理是否能增強(qiáng)缺血性腦卒中大鼠的耐受性，其次明確了HSP70在大鼠自體血栓栓塞模型中發(fā)揮的潛在角色，發(fā)現(xiàn)HSP70在預(yù)防缺血性腦卒中病情的進(jìn)一步進(jìn)展中能發(fā)揮關(guān)鍵性作用。TTC染色結(jié)果提示，與C組比較，Z組大鼠的腦梗死面積極明顯增大，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HZ組大鼠腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型成功；提示紅景天苷預(yù)處理對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈自體血栓栓塞模型的腦缺血損傷有減輕作用，與Han[16]的結(jié)果相似。而Han[16]的研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)過(guò)紅景天苷預(yù)處理可減輕腦缺血再灌注損傷，可能與降低血-腦脊液屏障通透性、減輕腦水腫及降低腫瘤壞死因子α的表達(dá)有關(guān)。但本研究結(jié)果提示，紅景天苷預(yù)處理可使HSP70表達(dá)量增加，至于通過(guò)何種機(jī)制及通路發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。