王淑敏 張 鴻 羅水忠 李興江 趙妍嫣 鐘昔陽 姜紹通 鄭 志

(合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230009)

小麥面筋蛋白是一種營養(yǎng)均衡，食用安全的天然植物蛋白，具有來源廣、成本低等特點(diǎn)。由于其良好的黏彈性、可降解性及成膜性，因而被廣泛應(yīng)用于焙烤食品、生物基礎(chǔ)材料等領(lǐng)域［1－3］。小麥面筋蛋白是球蛋白結(jié)構(gòu)，且對熱敏感，高溫?zé)嵴T導(dǎo)處理會破壞其分子內(nèi)或分子間相互作用，使位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)得以暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或者聚集［4］。有報(bào)道稱熱誘導(dǎo)聚集體的形成降低了小麥面筋蛋白在披薩等焙烤食品中的加工性能［5］，因而對小麥面筋蛋白進(jìn)行改性處理，以減少其熱誘導(dǎo)聚集體，對于其加工應(yīng)用具有重要意義。

蛋白質(zhì)脫酰胺是通過將蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)化為高疏水性的羧基，增加凈負(fù)電荷數(shù)，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并提升其溶解性及其它功能性質(zhì)［6－7］。蛋白質(zhì)脫酰胺的方法主要有化學(xué)法和酶法，采用酶法脫酰胺在溫和性、高效性、安全性方面更具有優(yōu)勢［8－9］。目前可用于脫酰胺的酶有蛋白酶、蛋白質(zhì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、肽谷氨酰胺酶及蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(PGase)。其中PGase已被用于米谷蛋白、玉米蛋白等食品蛋白質(zhì)改性，研究發(fā)現(xiàn)PGase明顯改善了米谷蛋白在弱酸性及中性條件下的溶解性［10］，也增加了玉米蛋白在中性條件下的乳化性［11］。小麥面筋蛋白中富含Gln殘基，利用PGase處理小麥面筋蛋白，可以有效促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，并降低其致敏性［12］。先前關(guān)于PGase脫酰胺結(jié)合熱誘導(dǎo)對乳清分離蛋白的影響研究表明，PGase處理后乳清分離蛋白的熱誘導(dǎo)聚集體減少，且凝膠質(zhì)地更加柔軟［13］。盡管目前已有大量關(guān)于熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白的報(bào)道［14－15］，但采用PGase進(jìn)行熱誘導(dǎo)前預(yù)處理，研究其對熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白構(gòu)象及凝膠性質(zhì)影響的報(bào)道較少。

采用稀釋的小麥面筋蛋白溶液研究PGase脫酰胺后熱誘導(dǎo)處理對小麥面筋蛋白構(gòu)象的影響，并利用質(zhì)構(gòu)儀、掃描電子顯微鏡等研究PGase處理小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品凝膠性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)的變化，探討其構(gòu)象與凝膠性質(zhì)之間的關(guān)系。以期拓寬小麥面筋蛋白的應(yīng)用范圍，為其高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白:安徽瑞福祥食品有限公司;蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(SD － C100S，EC 3.5.1.2):阿瑪諾天野酶制劑商貿(mào)(上海)有限公司;去離子水為實(shí)驗(yàn)室采用Milli－Q凈水系統(tǒng)進(jìn)行自制;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等化學(xué)試劑均為分析純級:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Q200型差示掃描量熱儀:美國Bio－Rad公司;Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀:美國熱電公司;JSM－6490LV掃描電子顯微鏡:日本電子公司;TA－XT plus物性測定儀:美國Stable Micro System公司;SHIMADZU RF－5301 PC型熒光分光光度計(jì):島津(香港)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 未經(jīng)熱誘導(dǎo)處理及熱誘導(dǎo)處理脫酰胺小麥面筋蛋白的制備

將小麥面筋蛋白溶于200 mM，pH=7.0的磷酸鹽緩沖液配制成7%(m/V)的懸濁液，分別加入1、3、5、10 U/g的 PGase，于搖床中 40 ℃，110 r/min條件下脫酰胺反應(yīng)1 h，隨后立即冰浴冷卻。為探究PGase脫酰胺隨后熱誘導(dǎo)處理對小麥面筋蛋白構(gòu)象的影響，需制備未經(jīng)熱誘導(dǎo)處理及熱誘導(dǎo)處理的脫酰胺小麥面筋蛋白樣品。脫酰胺反應(yīng)結(jié)束后，將樣品分為兩部分:一部分直接冷凍干燥，即得到未經(jīng)熱誘導(dǎo)處理的脫酰胺小麥面筋蛋白樣品，分別記為DWG －1、DWG －3、DWG －5、DWG －10;另一部分置于90℃水浴加熱40 min，隨后冰浴冷卻，凍干后得到熱誘導(dǎo)處理的脫酰胺小麥面筋蛋白樣品，分別記為HDWG －1、HDWG －3、HDWG －5、HDWG －10。未處理及只經(jīng)過熱誘導(dǎo)處理的小麥面筋蛋白分別記為WG、HWG，作為對照。

1.3.2 PGase脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備

脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠是采用12%的小麥面筋蛋白懸濁液制備得到。將小麥面筋蛋白加入去離子水中，攪拌30 min分別加入1、3、5、10 U/g的PGase，脫酰胺及熱誘導(dǎo)處理同1.3.1所述，隨后立即冰浴冷卻，即得到脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品，分別記為 gel－1，gel－3，gel－5，gel－10，未加入PGase相同條件下制備的小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠記為ck。凝膠樣品于4℃冰箱過夜后用于凝膠性質(zhì)測定。

1.4 分析方法

1.4.1 脫酰胺度測定

脫酰胺度用脫酰胺反應(yīng)過程中產(chǎn)生氨的量與小麥面筋蛋白完全脫酰胺產(chǎn)生氨的量之比來表示，其中氨含量的測定采用康威氏擴(kuò)散皿法［16］。

1.4.2 內(nèi)源性熒光光譜分析

將DWG及HDWG樣品分別溶于200 mM，pH=8.2的磷酸鹽緩沖液，配制成5 mg/mL的懸濁液，于25℃，8000 r/min離心10 min，取50μL上清液于石英比色皿中，使用熒光分光光度計(jì)測定在激發(fā)波長為295 nm時，樣品蛋白在320－460 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。

1.4.3 紅外光譜分析

采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法測定DWG及HDWG樣品中各二級結(jié)構(gòu)含量。在Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀中對樣品進(jìn)行32次全波段掃描(400～4 000 cm－1)，選擇圖譜中1 600～1 700 cm－1的酰胺 I帶區(qū)域進(jìn)行分析，依據(jù) Wang等［17］對酰胺Ⅰ帶各二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域劃分，計(jì)算出二級結(jié)構(gòu)含量。

1.4.4 熱特性分析

準(zhǔn)確稱取3～5 mg DWG及HDWG樣品于鋁盤中，壓盤，以空盤為對照，采用TA－Q200－DSC以10℃/min的升溫速率在20～100℃之間進(jìn)行熱掃描，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，變性溫度和變性焓由DSC自帶軟件進(jìn)行分析。

1.4.5 凝膠強(qiáng)度

采用TA－XT plus物性測定儀測定小麥面筋蛋白凝膠樣品的凝膠強(qiáng)度，測定參數(shù)為:測前速度5 mm/s;測中速度2 mm/s;測后速度5 mm/s;目標(biāo)深度為10 mm;探頭對凝膠按壓變形時所產(chǎn)生的最大破壞力作為凝膠強(qiáng)度。

1.4.6 保水性

小麥面筋蛋白凝膠樣品的保水性測定參照Cao等［18］的方法。取3 g樣品切成4 mm×4 mm×4 mm的小塊，置于離心管中，于8000 r/min離心20 min，用濾紙將離心出來的水分吸除，再次稱重。保水性(WHC)計(jì)算公式:

式中:W1為離心前凝膠樣品的質(zhì)量/g;W2為移除水分后凝膠樣品的質(zhì)量/g。

1.4.7 非可凍結(jié)水含量

總含水量(Wt)測定:參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中直接干燥法。

可凍結(jié)水含量(Wf)測定:參照Chen等人［19］的方法。取3～5 mg小麥面筋蛋白凝膠樣品于鋁盤中，壓盤，以空盤作對照，熱掃描以10℃/min的升溫速率從－50℃升至60℃，氮?dú)饬魉?0 mL/min，變性焓由DSC自帶軟件進(jìn)行分析?？蓛鼋Y(jié)水含量為每克濕凝膠樣品的變性焓與純水變性焓(334 J/g)的比值。非可凍結(jié)水含量(Wnf)計(jì)算公式:

1.4.8 微觀形貌觀察

將小麥面筋蛋白凝膠樣品切成3 mm×3 mm×1 mm的小塊，經(jīng)凍干后進(jìn)行噴金處理，采用掃描電子顯微鏡在25 KV的加速電壓下觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少三次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性(P＜0.05)分析，通過Origin Pro 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥面筋蛋白PGase脫酰胺處理

為研究PGase對小麥面筋蛋白的影響，測定了不同酶添加量時DWG樣品的脫酰胺度(DD)及水解度(DH)，結(jié)果如表1所示。DWG樣品的DD和DH值均隨著酶添加量的增加而增加;但相比于脫酰胺度，水解度增加較緩慢，且處于較低水平(＜2%)。有報(bào)道稱PGase處理會促使蛋白質(zhì)發(fā)生水解反應(yīng)［20］:一方面脫酰胺反應(yīng)將Gln轉(zhuǎn)化為Glu，分子內(nèi)靜電斥力增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子裂解。另一方面脫酰胺導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子伸展，從而釋放一些小肽片段。這與 Suppavorasatit等［9］的結(jié)果一致，在 PGase脫酰胺反應(yīng)的同時伴隨著較小程度的水解反應(yīng)發(fā)生。

表1 PGase處理小麥面筋蛋白樣品脫酰胺度和水解度的變化

2.2 PGase脫酰胺與熱誘導(dǎo)處理對小麥面筋蛋白構(gòu)象的影響

2.2.1 內(nèi)源性熒光光譜分析

色氨酸、酪氨酸等氨基酸能夠發(fā)射熒光，通過分析DWG和HDWG樣品內(nèi)源性熒光曲線，可以表征小麥面筋蛋白氨基酸微環(huán)境及結(jié)構(gòu)的變化［21］。由圖1可知，隨著酶添加量增加，DWG樣品的熒光強(qiáng)度(FI)顯著增加，其中DWG－10的FI值是WG的3.5倍。這是由于PGase處理后負(fù)電荷增多，分子內(nèi)或間靜電斥力增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，暴露出更多的色氨酸殘基至親水環(huán)境中，因而蛋白質(zhì)色氨酸微環(huán)境極性增加。HDWG樣品的 FI值變化趨勢與DWG樣品相同，不同的是，熱誘導(dǎo)處理后脫酰胺小麥面筋蛋白的FI值減小，這可能是由于熱誘導(dǎo)處理導(dǎo)致小麥面筋蛋白發(fā)生熱變性聚集［13］。隨著酶添加量增加，DWG和HDWG樣品的最大發(fā)射波長(λmax)均未發(fā)生明顯的變化。但與DWG樣品相比，HDWG樣品的λmax發(fā)生紅移，表明熱誘導(dǎo)處理使小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖1 脫酰胺及熱誘導(dǎo)處理小麥面筋蛋白樣品內(nèi)源性熒光光譜

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜(FTIR)可以表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象，其中酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm－1)是分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最靈敏的區(qū)域。DWG及HDWG樣品二級結(jié)構(gòu)含量如圖2所示，可以看出小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由β–折疊組成。隨著PGase添加量增加，DWG樣品α–螺旋和β–轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加，而β–折疊結(jié)構(gòu)含量降低。有報(bào)道稱β–折疊結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，而α–螺旋、β–轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比較靈活［22］，表明PGase處理使小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)靈活性增加。另外Glu是組成β–轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的主要成分，隨著脫酰胺反應(yīng)產(chǎn)生更多的Glu，DWG樣品β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加。與 WG相比，HWG樣品α－螺旋結(jié)構(gòu)含量減少，β－折疊結(jié)構(gòu)含量增加，這歸因于小麥面筋蛋白的熱誘導(dǎo)聚集。楊芳［23］在對豆腐凝膠形成機(jī)理的研究中提到，分子間β－折疊結(jié)構(gòu)與蛋白聚集體的形成有關(guān)。在圖2a中 DWG樣品β－折疊結(jié)構(gòu)含量降低，表明脫酰胺處理后蛋白質(zhì)聚集體減少;同時HDWG樣品的β－折疊結(jié)構(gòu)含量也具有同樣的變化趨勢，即隨著酶添加量的增加而減少，且通過比較發(fā)現(xiàn)DWG樣品的β－折疊結(jié)構(gòu)含量較HDWG樣品稍低，從而表明PGase處理在一定程度上能夠抑制小麥面筋蛋白熱變性聚集。此外，我們通過分析α－螺旋與β－折疊結(jié)構(gòu)含量的比值(數(shù)據(jù)未給出)的變化，也得出了相同的結(jié)論。

2.2.3 熱特性分析

DSC圖譜中變性溫度Td和熱焓值ΔH能夠反映蛋白質(zhì)變性狀態(tài):ΔH能夠表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序程度，ΔH值越大，則蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加有序;Td能夠表示蛋白質(zhì)聚合程度，Td值越大，則蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密［24］。DWG和HDWG樣品的DSC圖譜及熱特性參數(shù)如圖3和表2所示。由圖3可知，DWG和HDWG樣品均呈現(xiàn)向上的吸熱峰，表明小麥面筋蛋白變性是一個吸熱過程。在表2中，隨PGase添加量增加，DWG樣品Td值先降低后增加，說明PGase處理后小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)伸展，但并不會發(fā)生持續(xù)伸展，當(dāng)達(dá)到一定的DD后又有所聚集;這可能是由于蛋白質(zhì)伸展過程中疏水區(qū)域的暴露，導(dǎo)致疏水相互作用增加，促使蛋白分子聚集。與WG相比，HWG樣品Td值增大，表明小麥面筋蛋白發(fā)生熱變性聚集;而ΔH值則顯著降低，說明熱誘導(dǎo)處理后其蛋白結(jié)構(gòu)變得更加無序。與HWG相比，HDWG樣品Td值隨著酶添加量的增加而降低，而ΔH值則持續(xù)增大，說明脫酰胺能夠抑制小麥面筋蛋白的熱誘導(dǎo)聚集行為，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加有序。

圖2 DWG樣品及HDWG樣品二級結(jié)構(gòu)含量的變化

表2 脫酰胺及熱誘導(dǎo)處理小麥面筋蛋白樣品的熱特性參數(shù)

圖3 脫酰胺及熱誘導(dǎo)處理小麥面筋蛋白樣品DSC圖譜

2.3 PGase脫酰胺對小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的影響

2.3.1 凝膠強(qiáng)度和保水性分析

凝膠強(qiáng)度和保水性是兩個重要的凝膠特性，能夠反映凝膠體系中蛋白質(zhì)與水之間相互作用［25］。小麥面筋蛋白凝膠樣品的凝膠強(qiáng)度和保水性如圖4所示，可以看出隨著PGase添加量增加，小麥面筋蛋白凝膠樣品的凝膠強(qiáng)度和保水性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但均明顯高于相應(yīng)對照組，表明PGase改性有助于提高小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的凝膠性質(zhì);其中g(shù)el－3的凝膠強(qiáng)度和保水性均最大，分別為903.27 N和78.70%。一方面PGase處理后小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)伸展，暴露出更多的疏水殘基，而后疏水相互作用導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)重排，從而形成更加均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò);另外脫酰胺反應(yīng)導(dǎo)致Glu殘基增多，同時蛋白分子內(nèi)靜電斥力及親水區(qū)域也增加，從而凝膠強(qiáng)度和保水性增加。酶添加量繼續(xù)增多，凝膠強(qiáng)度和保水性反而稍有降低，這可能是由于更多的酶添加量、更大的脫酰胺程度導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，從而進(jìn)一步影響了其凝膠樣品的凝膠性質(zhì)。這說明PGase能夠一定程度上抑制小麥面筋蛋白的熱變性聚集。

圖4 脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品凝膠強(qiáng)度和保水性的變化

2.3.2 非可凍結(jié)水含量分析

在蛋白質(zhì)凝膠中，凝膠網(wǎng)絡(luò)－水相互作用能夠?qū)ζ浣Y(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生顯著影響，從而對于決定和維持蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。有報(bào)道將凝膠中的水分為非可凍結(jié)水及可凍結(jié)水(包括可凍結(jié)結(jié)合水、自由水)兩類，并認(rèn)為水分分布會顯著影響凝膠的質(zhì)構(gòu)及穩(wěn)定性［26］。如圖5所示，隨著PGase添加量增加，小麥面筋蛋白凝膠樣品中凍結(jié)水含量降低，非可凍結(jié)水含量相應(yīng)增加;這是由于PGase改性后較高的電荷密度使得可凍結(jié)水與肽鏈相互作用增加，轉(zhuǎn)換為非可凍結(jié)水;另外PGase處理后，蛋白質(zhì)與水結(jié)合能力增加，導(dǎo)致小麥面筋蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)持水性增大，親水基團(tuán)相互作用也促使更多的非可凍結(jié)水形成。此外，小麥面筋蛋白凝膠樣品中總水含量與非可凍結(jié)水含量變化一致，也隨著酶添加量的增大而增加。有報(bào)道稱凝膠樣品中較高的總水含量及非可凍結(jié)水含量一般與其較高的保水性有關(guān)［19］，在本研究中當(dāng)酶添加量為5 U/g時，總含水量及非可凍結(jié)水含量更高，其中g(shù)el－5中非可凍結(jié)水含量為19.56%，是對照組的2倍。

圖5 脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品水分分布

2.3.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品的微觀形貌如圖6所示。由圖6可知，未經(jīng)脫酰胺改性的小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的結(jié)構(gòu)孔徑較大，且分布不均，呈海綿狀結(jié)構(gòu)。隨著PGase添加量增加，小麥面筋蛋白凝膠樣品孔徑減小，形成了多孔且更加有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);這與Cao等［18］的測定結(jié)果相一致，較高的非可凍結(jié)水含量對應(yīng)著更高凝膠強(qiáng)度且更緊密結(jié)構(gòu)的凝膠網(wǎng)絡(luò)，這對于小麥面筋蛋白凝膠產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了依據(jù)。

圖6 脫酰胺小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠樣品的掃描電子顯微鏡圖(×250)

3 結(jié)論

3.1 PGase脫酰胺導(dǎo)致小麥面筋蛋白構(gòu)象發(fā)生不同于熱誘導(dǎo)處理所導(dǎo)致的變化:PGase脫酰胺使小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)伸展;熱誘導(dǎo)處理使得小麥面筋蛋白發(fā)生熱變性聚集而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變得無序;但PGase脫酰胺能夠在一定程度上抑制小麥面筋蛋白的熱誘導(dǎo)聚集。

3.2 PGase脫酰胺提高了小麥面筋蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的凝膠強(qiáng)度和保水性;且PGase處理后小麥面筋蛋白與水相互作用增加，使得其凝膠樣品的非可凍結(jié)水含量增加。此外，適度的PGase脫酰胺有利于熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白形成更加有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。