王杰 郭志遠(yuǎn) 冀云鵬 朱博 侯麗青 周燕 王曉華

1997年Lo等[1]在孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)存在胎兒游離DNA。由此開始，國內(nèi)外學(xué)者就胎兒游離DNA的生化特征及相應(yīng)的各種細(xì)胞分子檢測技術(shù)進(jìn)行了不斷的探索研究[2-3]，近年來，一種全新的無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(noninvasive prenatal DNA testing, NIPT)方法被用于孕期胎兒染色體非整倍體篩查，該項技術(shù)在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。目前NIPT可以對 21-三體、18-三體和13-三體以及其他的性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidies, SCAs)等進(jìn)行檢測[4]，相對于傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查，NIPT研究的數(shù)據(jù)有著更高的準(zhǔn)確性和更低的假陽性率[4-7]，但是NIPT對于SCAs的敏感度和特異性卻略有降低[6-9]。本文通過對NIPT結(jié)果為SCAs高風(fēng)險的孕婦進(jìn)行追蹤分析，綜合胎兒和母親信息探討NIPT在SCAs檢測中準(zhǔn)確度降低的原因。

對象與方法

一、對象

選擇2015年—2016年在本院經(jīng)NIPT檢測結(jié)果為SCAs高風(fēng)險的3例樣本，經(jīng)告知談話并簽訂知情同意書后，進(jìn)行羊水穿刺胎兒染色體核型分析及孕婦外周血染色體基因芯片檢測，對孕婦的白細(xì)胞進(jìn)行染色體芯片檢測，并對所有樣本進(jìn)行產(chǎn)后追蹤隨訪。

二、方法：

1.無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測：抽取孕婦外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，分別以1 600 rcf及16 000 rcf低溫離心10 min后分離血漿；提取血漿中游離DNA及白細(xì)胞基因組DNA；對提取到的游離DNA利用index進(jìn)行標(biāo)記經(jīng)加接頭、PCR富集得到標(biāo)本的DNA文庫，經(jīng)Qubit 2.0檢測獲得文庫pooling，再經(jīng)過乳液PCR擴(kuò)增并上機(jī)測序獲得原始數(shù)據(jù)。將測得的序列與已知人類參考基因組序列(hg19)比對確定每一測序reads染色體的定位；而后計算每一樣本中每條染色體序列數(shù)目比率減去正常胎兒孕婦對照組的相應(yīng)染色體reads比率的均值后，除以對照組相應(yīng)染色體reads比率的標(biāo)準(zhǔn)差，最終得出標(biāo)準(zhǔn)化Z值。若Z值的絕對值≥3，提示高風(fēng)險；若-3

2.細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析：22G穿刺針抽取羊水20～30 ml，離心收獲羊水細(xì)胞，加5 ml培養(yǎng)液，分裝入兩個培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8 d后更換培養(yǎng)液。在第10～12天，鏡檢細(xì)胞群落長勢良好，則加入秋水仙素0.05 ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h；處理后取出培養(yǎng)瓶，加入EDTA胰酶2 ml消化。收集培養(yǎng)后羊水細(xì)胞進(jìn)行低滲、固定、滴片、烤片后進(jìn)行染色體鏡檢。使用德國萊卡GSL120染色體核型分析系統(tǒng)軟件至少分析5個分裂相，計數(shù)20個分裂相，異常增加分析分裂相。

臍帶血細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析，常規(guī)無菌采集臍帶血2 ml，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)68～72 h后常規(guī)收獲制片，顯帶及核型分析同羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析。

3.染色體基因芯片檢測：應(yīng)用Affymetrix公司的CytoScan HD全基因芯片掃描技術(shù)檢測白細(xì)胞全基因組CNVs。按試劑盒說明書操作，將樣本依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增、提純、定量，片段化處理，再將DNA溶液標(biāo)記后加入雜交試劑孵育，載入到芯片中進(jìn)行雜交反應(yīng)；洗染芯片后掃描分析。用Affymetrix GeneChip Scaner 生成原始cel文件，通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析，利用CHAS軟件分析結(jié)果。

CNVs評估方法：對于檢測出的CNVs，首先查詢UCSC、DECIPHER、ISCA、PubMed、CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants)、既往文獻(xiàn)及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online Mendelian inheritance in man,OMIM)，均確認(rèn)為致病性CNVs。

結(jié) 果

對3例NIPT結(jié)果提示SCAs高風(fēng)險的樣本，進(jìn)行羊水細(xì)胞傳統(tǒng)核型分析，發(fā)現(xiàn)胎兒核型為46，XN，與NIPT檢測結(jié)果不一致。分別對母體外周血進(jìn)行染色體基因芯片的檢測，結(jié)果分別為46，XX/45,X0，嵌合度為55%；46，XX/45,X0，嵌合度為20%；47，XXX；見表1。出生半年后嬰兒進(jìn)行外周血染色體核型分析與羊水核型一致，提示母體自身X染色體的異常會導(dǎo)致NIPT對SCAs的檢測結(jié)果與胎兒性染色體核型不一致，表現(xiàn)出假陽性。

表1 NIPT SCAs高風(fēng)險標(biāo)本信息及檢測結(jié)果

討 論

人類染色體非整倍體源于生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時或胚胎著床前卵裂期有絲分裂時出現(xiàn)錯誤[10]，絕大多數(shù)非整倍體疾病都是致命的，可引起著床前胚胎發(fā)育停滯或孕早期胎兒自發(fā)性流產(chǎn)，只有很少一部分染色體非整倍體異常但不會導(dǎo)致妊娠失敗，如T21(唐氏綜合征)、T18(愛德華氏綜合征)、T13(帕陶氏綜合征)、X染色體單體(特納綜合征)、XXY綜合征(克氏綜合征)、XXX綜合征(三X染色體綜合征)、XYY綜合征(超雄綜合征)，新生兒中這些染色體疾病的發(fā)病率約為0.3%[11]。近30年，隨著產(chǎn)前篩查及診斷應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的檢測[12]，使得新生兒染色體疾病的數(shù)量有所降低[12-13]。母體血清學(xué)篩查、超聲以及絨毛穿刺和羊水穿刺技術(shù)，與染色體核型分析及NIPT技術(shù)的交叉與結(jié)合[12,14]，對于常見的常染色體非整倍體T21、T18、T13已經(jīng)有較高的檢出率。其中NIPT作為一種高精度的產(chǎn)前篩查方法，具有更高的準(zhǔn)確性和更低的假陽性率。但是NIPT對于SCAs的敏感度和特異性卻略有降低[6-9]，最初在進(jìn)行NIPT篩查常染色體非整倍體高危孕婦中，SCAs的篩查敏感率較低，在1 916例低危中國孕婦的NIPT篩查中，4個性染色體異常僅2個被篩出，敏感性僅為50%[15]。

造成這種檢測差異的原因是多方面的，其中包括測序本身的難題，由于X染色體含有較多的GC堿基，并且X和Y染色體標(biāo)記序列的相似性，另外Y染色體較小亦可能會掩蓋數(shù)據(jù)的真實結(jié)果。最近的研究表明，限制性胎盤嵌合(confined placental mosaicism ，CPM[9,16-17]或胎盤嵌合[17-19]以及胎兒嵌合[14]也是造成SCAs檢測準(zhǔn)確度降低的原因。在本研究中，發(fā)現(xiàn)母體染色體的改變或嵌合是導(dǎo)致NIPT對SCAs檢測結(jié)果造成干擾的一個重要因素，X染色體的有效片段在母體血漿中呈動態(tài)變化，影響著胎兒X染色體DNA片段的計算。

存在SCAs異常的孕婦雖然本人通常并不表現(xiàn)出明顯癥狀，但SCAs卻是最常見的母體染色體嵌合異常，其發(fā)生率為1/400，比大多數(shù)一般的常染色體非整倍體高[20]。同時，由于高齡孕婦會經(jīng)歷漸進(jìn)的和選擇性的丟失X染色體，將原來血液中的染色體核型由XX轉(zhuǎn)變?yōu)閄0/XX嵌合[14,21]。以上原因都使母體本身存在SCAs的幾率相應(yīng)增加。

本研究通過對潛在胎兒SCAs的樣本進(jìn)行多方法的聯(lián)合檢測，最后明確診斷了胎兒的染色體核型，同時分析了NIPT對于SCAs檢測出現(xiàn)假陽性的可能原因。提示為進(jìn)一步提高NIPT對于SCAs的檢測準(zhǔn)確度，將來對胎兒SCAs高風(fēng)險的孕婦可結(jié)合外周血染色體核型分析或基因芯片檢測，以避免SCAs假陽性的出現(xiàn)。