張艷霞，王文革

（中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院 兒科，北京100142）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由各種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。哮喘病理變化主要包括3種特征性表現(xiàn)：氣道慢性炎癥、氣流受阻及氣道高反應(yīng)，其中氣道慢性炎癥被認(rèn)為是哮喘的本質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)[1]在各種免疫反應(yīng)如自身免疫、宿主防御病原體及炎癥反應(yīng)中，白細(xì)胞介素17（IL-17）均參與其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。IL-17可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在氣道中聚集，加重哮喘的氣道炎癥，從而參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，也可以抑制炎癥，在哮喘的氣道中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。目前IL-17在哮喘中起促炎還是抑炎的作用尚未明確。吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroids, ICS）可以減少細(xì)胞因子及炎癥細(xì)胞在氣道中的聚集、浸潤(rùn)[2]，是長(zhǎng)期控制哮喘的有效藥物，其中布地奈德為其代表性藥物[3]。目前關(guān)于布地奈德治療哮喘作用機(jī)制的研究主要涉及通過(guò)干預(yù)IL-1、IL-10、IL-5、IL-23等細(xì)胞因子的表達(dá)，而對(duì)IL-17表達(dá)影響的研究較少。本研究利用哮喘小鼠模型，研究哮喘小鼠中IL-17的表達(dá)，經(jīng)布地奈德干預(yù)后，哮喘小鼠IL-17表達(dá)的變化。進(jìn)而探討IL-17在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用以及布地奈德控制哮喘的作用機(jī)制與IL-17的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

布地奈德混懸液（1 mg/2 ml，LOT320888）購(gòu)自上海阿斯利康制藥有限公司，十二水硫酸鋁鉀（237086）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA，A5253～250 g，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，HE及AB-PAS染色試劑盒購(gòu)自武漢谷歌生物公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）IL-17試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，DEPC水購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，TIAN Script RT KIT、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。壓縮空氣式霧化機(jī)購(gòu)自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠24只，4周齡，體重（13±1）g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[SCXK（京）2016-0004]，小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院（304醫(yī)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。其余實(shí)驗(yàn)于中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 模型復(fù)制

復(fù)制哮喘小鼠模型，參考文獻(xiàn)[4-5]并加以改進(jìn)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，經(jīng)隨機(jī)數(shù)表法分為正常組、哮喘組及布地奈德組，每組8只。哮喘組與布地奈德組每只小鼠分別于飼養(yǎng)的第8、15、22天腹腔注射OVA致敏液0.2 ml[（內(nèi)含十二水硫酸鋁鉀1 mg，OVA 100 μg，磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2 ml）]致敏。正常組小鼠腹腔只注射PBS。哮喘組及布地奈德組分別自飼養(yǎng)的第29天開始以5%OVA溶液霧化激發(fā)，正常組以PBS霧化吸入，1次/d，30 min/次，連續(xù)激發(fā)14 d后，布地奈德組在5% OVA激發(fā)前30 min給予布地奈德混合液4 ml（布地奈德混懸液1 mg/2 ml、生理鹽水2 ml）霧化吸入30 min。正常組及哮喘組小鼠均同時(shí)給予等量的生理鹽水。

1.4 取材

小鼠末次給予OVA、布地奈德混懸液霧化吸入后，禁食24 h，24 h后用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，引頸處死后，切開頸部及胸部皮膚，逐層分離組織，充分暴露氣管及雙肺，于氣道的上段做一橫向切口，以21 G的注射器針頭做氣管插管并固定，結(jié)扎右肺，將0.3 ml的PBS溶液緩慢灌注左肺并緩慢回抽灌洗液，重復(fù)灌洗3次，回收率為80%。將收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）以1 500 r/min，4℃離心10 min，回收上清液置入-80℃冰箱冷凍保存。取右肺-80℃冰箱冷凍保存。

1.5 小鼠肺組織病理切片的制備

收取BALF后，分離小鼠右肺，取約為1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小的肺組織，將其浸潤(rùn)于4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋，行小鼠肺組織切片，厚度約3 μm，行AB-PAS及HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肺組織中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，同時(shí)觀察支氣管管腔狹窄、氣道中杯狀細(xì)胞增生等典型的哮喘病理學(xué)改變。對(duì)各組肺組織進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)評(píng)分[6-7]，0分：無(wú)炎癥細(xì)胞；1分：少許炎癥細(xì)胞；2分：炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚為1個(gè)細(xì)胞；3分：大量分布均勻的炎癥細(xì)胞，或炎癥細(xì)胞形成環(huán)狀，層厚為2～4個(gè)細(xì)胞；4分：大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)，或炎癥細(xì)胞成環(huán)狀，層厚＞4個(gè)細(xì)胞。

1.6 BALF中IL-17表達(dá)水平的檢測(cè)

采用ELISA檢測(cè)BALF中IL-17的表達(dá)水平，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)小鼠肺組織中IL-17的表達(dá)

IL-17正向引物5'-AAGGCAAATACGGTGGTG TG-3'，反向引物 3'-CGCTGAGGAAGTGGGAAAAG-5'。所有cDNA樣品分別配置qRT-PCR反應(yīng)體系。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行：在反應(yīng)管內(nèi)依次加入 2×Super Real Pre Mix Plus（10 μl）、正向引物（10 μmol）（0.6 μl）、反向引物（10μmol）（0.6 μl）、cDNA（100 ng）、50×ROX Reference Dye △（0.4 μl），以RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系調(diào)至20 μl。將溶液混合后，短暫離心，將制備好的標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本上機(jī)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃ 15 min；95℃10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合方差齊性及正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不符合的進(jìn)行Tamhane’s檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVA激發(fā)后小鼠的行為表現(xiàn)

哮喘組以及布地奈德組小鼠激發(fā)后均出現(xiàn)不同程度的呼吸急促、喘息、煩躁不安、腹肌痙攣、搔鼻及站立不穩(wěn)等陽(yáng)性行為，短時(shí)間內(nèi)可自行緩解。其中布地奈德組的哮喘癥狀較哮喘組癥狀明顯減輕。正常組未見明顯的異常表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠肺組織病理改變

HE染色中正常組小鼠氣道黏膜未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管腔光滑，肺泡腔內(nèi)未見炎癥分泌物，無(wú)肺泡壁變薄。哮喘組小鼠氣道黏膜層可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞增生為主，黏膜上皮細(xì)胞腫脹，肺泡腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁變薄，氣道管腔變窄。經(jīng)布地奈德霧化吸入后，布地奈德組小鼠氣道黏膜可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮細(xì)胞仍有輕微的增厚，但與哮喘組小鼠相比明顯減輕，氣道管腔狹窄緩解（見圖1）。AB-PAS染色中正常組小鼠氣道上皮未見杯狀細(xì)胞，氣道平滑肌及基底膜未增厚，哮喘組小鼠氣道上皮可見明顯的杯狀細(xì)胞，氣道平滑肌及基底膜明顯增厚，經(jīng)布地奈德干預(yù)后，布地奈德組小鼠氣道上皮仍可見杯狀細(xì)胞，但比哮喘組相比明顯較少，氣道平滑肌增厚明顯減輕（見圖2）。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片圖 （HE×400）

圖2 各組小鼠肺組織病理切片圖（AB-PAS×400）

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥評(píng)分比較

各組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥評(píng)分，正常組為（0.000±0.000），哮喘組為（3.625±0.518），布地奈德組為（1.750±0.463），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=105.903，P =0.000）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組小鼠肺組織炎癥評(píng)分增高（t=19.811，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠肺組織炎癥評(píng)分增高（t=10.693，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組小鼠肺組織炎癥評(píng)分降低（t=-6.355，P=0.000）。

2.4 各組小鼠BALF中IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)比較

ELISA法檢測(cè)各組BALF中IL-17表達(dá)，正常組為（12.175±4.322）pg/ml，哮喘組為（58.750±10.026）pg/ml，布地奈德組為（29.522±8.900）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.020，P =0.000）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組中IL-17表達(dá)升高（t=12.496，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠中IL-17的表達(dá)升高（t=6.252，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組中IL-17的表達(dá)降低（t=-6.848，P=0.000）。

2.5 各組小鼠肺組織中IL-17 mRNA的表達(dá)比較

qRT-PCR目的基因的擴(kuò)增曲線，見圖3。qRTPCR目的基因的熔解曲線，見圖4。

qRT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)，正常組為（0.935±0.152）pg/ml，哮喘組為（6.898±1.559）pg/ml，布地奈德組為（3.613±0.681）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.390，P =0.000）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組中IL-17 mRNA表達(dá)升高（t=11.671，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠中IL-17 mRNA的表達(dá)升高（t=11.619，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組中IL-17 mRNA的表達(dá)降低（t=-5.372，P=0.000）。

圖3 目的基因的擴(kuò)增曲線

圖4 目的基因的熔解曲線

3 討論

Th17細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種新型的CD4+T細(xì)胞，一種獨(dú)立于Th1和Th2以外的輔助性T細(xì)胞。其特征性細(xì)胞因子為IL-17和IL-17F，IL-17F主要在黏膜防御反應(yīng)中起作用[8]。IL-17不僅可參與腫瘤、免疫性疾病，而且還與許多炎癥疾病有關(guān)。研究顯示[9]IL-17可以通過(guò)腫瘤壞死因子、IL-1的協(xié)同作用，放大炎癥效應(yīng)，進(jìn)而參與哮喘等炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展。IL-17具有很強(qiáng)的募集中性粒細(xì)胞以及促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子的作用[10]。哮喘是一種氣道慢性炎癥，有研究證明在哮喘患者肺組織、BALF、痰和血清中IL-17表達(dá)明顯增高[11-12]。但是IL-17在哮喘的肺組織中起抑制炎癥的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠BALF中IL-17的表達(dá)及肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)較正常組均增高，并且哮喘組的氣道中嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞與正常組比較有所增多，杯狀細(xì)胞亦增多。進(jìn)一步說(shuō)明IL-17與哮喘的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。

ICS是目前應(yīng)用最廣泛也是最有效的長(zhǎng)期控制、預(yù)防哮喘發(fā)作的首選藥物，其治療哮喘的作用已成為國(guó)際共識(shí)[13]，其中布地奈德是ICS中最常用的一種，抗炎效果好，霧化吸入的布地奈德可以局部、直接作用于氣道黏膜[14]，局部抗炎作用強(qiáng)，可以有效地減少全身不良反應(yīng)，更好地控制哮喘患者的氣道炎癥及降低呼吸道阻力，進(jìn)而緩解哮喘患者的呼吸困難、喘息等癥狀，以及縮短咳嗽持續(xù)的時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠的BALF中IL-17表達(dá)及肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)均升高，氣道中炎癥細(xì)胞及杯狀細(xì)胞增多，經(jīng)布地奈德干預(yù)治療后，降低哮喘小鼠肺中IL-17的表達(dá)，以及氣道中炎癥細(xì)胞減少。本研究提示IL-17在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有一定的作用，而布地奈德的干預(yù)可以降低IL-17的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞在氣道中聚集，減輕哮喘小鼠肺部氣道炎癥。

綜上所述，致敏小鼠在反復(fù)的抗原激發(fā)后，哮喘組小鼠的氣道中炎癥細(xì)胞聚集，杯狀細(xì)胞增多，炎癥評(píng)分較正常組、布地奈德組均高，BALF中IL-17表達(dá)及肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)均升高。而經(jīng)布地奈德干預(yù)后，與哮喘組比較，哮喘小鼠的氣道炎癥減輕，炎癥評(píng)分降低，BALF中IL-17表達(dá)及肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-17可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞在氣道中聚集，引起氣道炎癥，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)也表明布地奈德可抑制IL-17的合成、分泌，從而減輕氣道炎癥，進(jìn)一步揭示抑制IL-17分泌是布地奈德控制哮喘的作用機(jī)制之一。