王俊芳，劉佳佳，劉佳音

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2.河南大學(xué) 健康與護(hù)理學(xué)院，河南 開封 475004)

納豆是將黃豆蒸煮過后，在納豆枯草芽孢桿菌的發(fā)酵作用下制成的，是一種具有粘性、口感潤滑、營養(yǎng)成分極豐富的豆制品，其營養(yǎng)價(jià)值較大豆倍增[1,2]。研究表明，納豆發(fā)酵過程中納豆菌產(chǎn)生了一種能夠直接溶解纖維蛋白的堿性絲氨酸蛋白酶活性物質(zhì)，即納豆激酶(nattokinase)。納豆激酶是日本科學(xué)家須見洋行從納豆中首先發(fā)現(xiàn)并命名的，因其顯著的溶血栓作用而備受矚目[3]。納豆激酶的溶血栓能力明顯強(qiáng)于尿激酶、鏈激酶、t-PA、蛇毒制劑、DSPA等具有一定副作用的溶血栓藥物。納豆激酶作用迅速，使用安全，無毒副作用，半衰期長，具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。隨著血栓類疾病對人類健康的危害日益加重，人們開始注重養(yǎng)生，食用納豆激酶保健品的人們越來越多。而納豆作為調(diào)味品，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、降血壓、抗癌、防治骨質(zhì)疏松、美容等保健功能[4-6]。由于購買的商品納豆大多都有胺臭味，聞起來有點(diǎn)讓人難以接受。因此，本文旨在對納豆激酶產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選、鑒定，以獲得符合國人口味的醬香型發(fā)酵納豆生產(chǎn)用菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

自制豆豉、豆醬等發(fā)酵豆制品。

1.1.2 主要試劑

凝血酶(1000 U)、纖維蛋白原、尿激酶(≥7200 U)：均購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑：均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，用來活化及保藏菌種。

初篩選培養(yǎng)基(牛奶平板)：用來篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株，配制方法是向配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為15 g/L的牛奶，溫度105 ℃，時(shí)間30 min，單獨(dú)滅菌。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，用于菌種的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將不同的豆豉、豆醬等樣品各取5 g，分別加入裝有20 mL無菌水和10顆玻璃珠的錐形瓶中，在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min下振蕩20 min，再于室溫下浸提1 h，轉(zhuǎn)速3000 r/min離心5 min，即制得菌懸液。

1.2.2 納豆激酶生產(chǎn)菌株的篩選

1.2.2.1 初篩

將制得的菌懸液于80 ℃水浴鍋中熱處理20 min，再將不同樣品制得的菌懸液用生理鹽水倍比稀釋，取10-1，10-2，10-3，10-44個(gè)濃度梯度，分別取100 μL涂布牛奶平板，在30 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h。

1.2.2.2 復(fù)篩

觀察牛奶平板上長出的單菌落，選出透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株，用無菌牙簽接種到牛奶平板上。放入30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再次選出透明圈比值較大的菌株。將篩選出的菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，重復(fù)篩選3次。

挑取純化的單菌落，接種到LB斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 納豆激酶酶活分析

1.2.3.1 制備納豆激酶粗酶液

將篩選得到的高產(chǎn)菌株用無菌牙簽挑取，分別接種到30 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在全溫度振蕩培養(yǎng)箱中在30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)22 h。取出后在4 ℃，轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心10 min，取其上清液，即得到納豆激酶粗酶液。

1.2.3.2 配制改良的纖維蛋白原平板

參考Astrup等的方法[8]：利用瓊脂糖、凝血酶和纖維蛋白原按比例混合制成人工血栓平板：配制瓊脂糖溶液：將0.1 g的瓊脂糖加入到10 mL蒸餾水中，用微波爐加熱使之溶解，在121 ℃滅菌20 min，使用前在45 ℃下恒溫水浴10 min；配制纖維蛋白原溶液：將0.01 g纖維蛋白原加入到10 mL 10 mol/L的PBS緩沖液中(pH為7.44)，振蕩搖勻后在45 ℃下恒溫水浴10 min備用；將凝血酶稀釋至100 U/mL，取10 μL加入到配制好的瓊脂糖溶液中，快速搖晃均勻，倒入9 cm的無菌平板中，在室溫下放置一段時(shí)間使其充分冷卻凝固。

1.2.3.3 制作尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考張杰等描述的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法[9]。首先將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至50，200，400，600，800，1000 U/mL，分別取10 μL上樣于配制好的均勻擺放了牛津杯的纖維蛋白平板上，在室溫下靜置10 min，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，取出后用游標(biāo)卡尺測量各個(gè)溶解圈的直徑，計(jì)算出各個(gè)溶圈的面積。將尿激酶的酶活力單位數(shù)作為橫坐標(biāo)，將溶解圈的面積作為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.4 納豆樣品酶活檢測

加樣：將滅過菌的牛津杯均勻放置在纖維蛋白平板上，加入10 μL納豆激酶粗酶液，在室溫下靜置10 min后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

觀察溶解圈的大小，測量其直徑，計(jì)算溶解圈面積。對照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的酶活。

1.2.4 納豆激酶產(chǎn)生菌生長曲線的測定

將篩選出的納豆激酶產(chǎn)生菌接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中，放入37 ℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔2 h測量其OD595值，重復(fù)測量3次。將OD595值作為縱坐標(biāo)，生長時(shí)間作為橫坐標(biāo)，做出納豆激酶產(chǎn)生菌的生長曲線。

1.2.5 納豆制備及其感官評價(jià)

從本實(shí)驗(yàn)篩選出的納豆菌株中，挑選出纖溶活性較好的菌株，另外，再以枯草芽孢桿菌1-44菌株作為對照，分別制備待發(fā)酵菌株的種子液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

挑選大小相對一致、無蟲咬和顆粒飽滿的大豆。將大豆清洗干凈，以3∶1的比例加入水，在室溫下浸泡18 h，將水過濾掉，分裝到250 mL的錐形瓶中，40 g/瓶，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃下蒸煮30 min。取出后冷卻至50 ℃左右，加入2 mL菌懸液，充分混勻，在37 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后放入4 ℃冰箱中，后熟24 h后即得到納豆制品。

將制得的納豆轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻后測定其拉絲長度。具體方法是用玻璃棒挑起，以20 cm作為1個(gè)單位，拉出20 cm后再從中間挑起20 cm，重復(fù)至拉斷為止。另外，對納豆的氣味、口感、色澤、拉絲和納豆激酶酶活等指標(biāo)分別進(jìn)行感官評價(jià)。評價(jià)方式參考馬明等的方法進(jìn)行[10]。品評人數(shù)為10人，分別對納豆單項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行打分，并綜合評價(jià)。

1.2.6 納豆激酶產(chǎn)生菌的鑒定

1.2.6.1 形態(tài)觀察和生理生化鑒定

參照東秀珠《常見細(xì)菌鑒定手冊》，對篩選得到的納豆激酶生產(chǎn)菌進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)[11]。

1.2.6.2 PCR檢測

PCR產(chǎn)物由上海生工擴(kuò)增及測序。提取目標(biāo)菌株基因組，并以其為模板，采用細(xì)菌16Sr DNA通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 15.9 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+(1.5 mmol/L)1.5 μL，dNTP (10 mmol/L)2.0 μL，P1 (10 mmol/L)1.0 μL，P2 (10 mmol/L) 1.0 μL，模板1.0 μL，rTaq酶0.1 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.6.3 16S rDNA 測序及同源性分析

測序結(jié)果在RDP 網(wǎng)站(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)數(shù)據(jù)庫檢出與所測菌16S rDNA 序列同源性較高的序列，判斷16S rDNA 基因鑒定結(jié)果。

1.2.6.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在RDP 核苷酸數(shù)據(jù)庫中挑選出同源性較為相近的16S rDNA 序列，用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行1000次步長計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 不同培養(yǎng)條件下對納豆激酶產(chǎn)生菌的酶活測定

分別在不同的初始pH值和發(fā)酵溫度下，針對篩選出的纖維活性最高的菌株，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的實(shí)驗(yàn)，觀察這些培養(yǎng)條件對產(chǎn)納豆激酶的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

(1)將250 mL的瓶分裝30 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，初始pH分別調(diào)為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，接種高產(chǎn)菌后于37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min下?lián)u床發(fā)酵24 h，測其OD595值及相對酶活。

(2)將高產(chǎn)菌接種到pH和鹽離子都一定的液體培養(yǎng)基中，分別放在25，28，35，37，40 ℃幾個(gè)不同溫度下發(fā)酵，24 h后分別測量其相對酶活，觀察溫度對產(chǎn)酶的影響。

(3)在配制液體培養(yǎng)基時(shí)，將牛肉膏培養(yǎng)基中原本單一的Na+換成用Mg2+，K+，Ca2+，Mn2+分別與Na+按一定比例組合加入，鹽離子加入量為0.2 g/L，pH都調(diào)為7，分裝成30 mL/瓶，接種高產(chǎn)菌，培養(yǎng)條件及酶活測定方法同(1)，比較各離子對產(chǎn)酶的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及以上，數(shù)據(jù)采用平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，計(jì)量數(shù)據(jù)組間比較利用Duncan檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆激酶生產(chǎn)菌株的篩選

利用牛奶平板對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行初篩選，共選出15株纖溶性明顯的菌株。測量這些菌株的透明圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算其比值。通過計(jì)算從中挑選出4株直徑比較大的菌株，結(jié)果見圖1。各菌株周圍均有明顯的透明圈，N-2菌株的直徑比最大，高于枯草芽孢桿菌1-44和1-37菌株的直徑比。

圖1 牛奶平板初篩納豆激酶產(chǎn)生菌Fig.1 Screening nattokinase producing strains in milk plate

2.2 納豆激酶酶活分析

通過測量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活，制得的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得到線性回歸方程：y=0.320x+54.13，R2=0.994，表明線性關(guān)系良好。

圖2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Urokinase standard curve

將測得的溶解圈面積對照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算可得。本實(shí)驗(yàn)從豆制品分離篩選出的幾株纖溶性好的菌種中，N-2菌株的酶活力最高，達(dá)到了1159 U/mL，結(jié)果見表1。

表1 不同菌株納豆激酶酶活Table 1 Nattokinase activity of different strains U/mL

2.3 納豆激酶產(chǎn)生菌生長曲線的測定

納豆激酶產(chǎn)生菌N-2的生長曲線見圖3，N-2菌在0～8 h時(shí)生長緩慢，處于生長延滯期；在8～12 h時(shí)活菌數(shù)量快速增加，處于對數(shù)生長期；在12～24 h處于生長穩(wěn)定期；24 h之后進(jìn)入生長衰亡期。

圖3 N-2菌株生長曲線Fig.3 Growth curve of N-2 strain

2.4 納豆制作及感官評價(jià)

分別利用N-1，N-2，N-3，N-4，1-44菌株發(fā)酵制備納豆。并按照相應(yīng)的評價(jià)指標(biāo)對大豆進(jìn)行品評打分，比較結(jié)果見圖4。

圖4 不同菌株發(fā)酵納豆指標(biāo)比較Fig.4 Comparison of the indexes of natto fermented by different strains

結(jié)果顯示：N-2菌株發(fā)酵納豆拉絲、口感和氣味等指標(biāo)都優(yōu)于其他菌株；1-44菌株發(fā)酵納豆色澤黃褐色，半透明狀，優(yōu)于其他菌株；其中用N-2菌株發(fā)酵制得的納豆拉絲長度為80 cm，且醬豆味更香濃；用1-44菌株發(fā)酵的納豆拉絲長度為30 cm，香味也稍次于N-2菌株發(fā)酵的納豆。通過對發(fā)酵納豆綜合評價(jià)，N-2優(yōu)于其他菌株。

N-2發(fā)酵結(jié)果及拉絲見圖5，N-2發(fā)酵制得的納豆初始為黃褐色，后熟結(jié)束顏色稍變深，口感酥軟，帶有獨(dú)特的醬香味，沒有胺臭味，攪動納豆時(shí)其表面的乳白色粘液增多，可以拉出長長的強(qiáng)韌不易斷的拉絲。

圖5 N-2菌株發(fā)酵的納豆Fig.5 Natto fermented by N-2 strain

注：左圖為三角瓶發(fā)酵納豆；右圖為納豆拉絲。

2.5 高產(chǎn)納豆激酶產(chǎn)生菌的鑒定

2.5.1 形態(tài)觀察

N-2菌株的菌落形態(tài)近似圓形，邊緣不整齊或裂成葉狀，乳白色不透明，且表面有褶皺。對N-2菌株進(jìn)行芽孢染色觀察，顯微觀察結(jié)果見圖6，菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，產(chǎn)芽孢，芽孢呈柱狀或橢圓形，芽孢中生，芽孢囊不明顯膨大；革蘭氏染色陽性。

圖6 N-2菌株革蘭氏染色Fig.6 Gram's stain of N-2 strain

2.5.2 生理生化鑒定

對N-2菌株的部分生理生化特征進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 N-2菌株生理生化測定Table 2 Physiological and biochemical determination of N-2 strain

2.5.3 N-2菌株16S rDNA同源性分析

將N-2菌株16S rDNA測序結(jié)果在RDP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，利用Classifier功能比對，結(jié)果顯示：N-2菌株屬厚壁菌門，類桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬；通過Seqmatch功能，將16S rDNA測序結(jié)果提交比對，結(jié)果顯示：N-2菌株與GenBank中的模式菌株解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensDSM7同源性達(dá)到99%。

2.5.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)Seqmatch比對結(jié)果，選擇與N-2菌株同源性較高的模式菌株16S rDNA 序列，用軟件MEGA 7.0鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行1000次步長計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖7)。在該系統(tǒng)發(fā)育樹上可見，N-2與GenBank中模式株BacillusamyloliquefaciensDSM7和BacillusamyloliquefaciensNBRC聚在同一個(gè)分支，驗(yàn)證可信度達(dá)89%。由以上分析可知，N-2是一株Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)。

圖7 N-2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of N-2 strain

注：樹枝上的數(shù)值為驗(yàn)證可信度；圖下端標(biāo)尺表示堿基置換頻率；上標(biāo)T表示菌株為模式菌株。

2.6 納豆激酶產(chǎn)生菌N-2菌株培養(yǎng)條件對酶活性的影響

2.6.1 培養(yǎng)基初始pH值對納豆激酶活性的影響

培養(yǎng)基不同初始pH，搖瓶發(fā)酵24 h后，分別測量相對酶活，結(jié)果見圖8。培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)的相對酶活最高，pH值為9時(shí)相對酶活最低。經(jīng)方差分析，培養(yǎng)基5個(gè)不同初始pH值，發(fā)酵結(jié)束后，酶活差異極顯著。經(jīng)多重比較，Duncan檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示：初始pH值為6的培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束酶活極顯著高于其他處理；pH值為5的培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束酶活顯著高于pH值為9的培養(yǎng)基；其他初始值之間發(fā)酵結(jié)束兩兩比較，均顯示酶活差異極顯著。

圖8 培養(yǎng)基初始pH對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.8 Effect of initial pH of culture medium on nattokinase activity of N-2 strain

注：小寫字母表示顯著度為P<0.05；大寫字母表示顯著度為P<0.01，下同。

2.6.2 發(fā)酵溫度對納豆激酶活性的影響

N-2菌株經(jīng)5個(gè)不同的培養(yǎng)溫度，分別培養(yǎng)發(fā)酵24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。35 ℃時(shí)的相對酶活最高，25 ℃發(fā)酵相對酶活最低。經(jīng)方差分析，5個(gè)培養(yǎng)溫度經(jīng)發(fā)酵24 h后，25 ℃與40 ℃發(fā)酵結(jié)束，酶活差異不顯著；28 ℃與40 ℃發(fā)酵結(jié)束，酶活差異顯著；35 ℃和37 ℃溫度與其他發(fā)酵溫度相比，均顯示酶活差異極顯著。

圖9 發(fā)酵溫度對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity of N-2 strain

2.6.3 不同鹽離子對納豆激酶活性的影響

N-2菌株以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加一定量鹽，培養(yǎng)發(fā)酵24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。與其他鹽相比，Ca2+對產(chǎn)酶的影響效果極顯著，其他鹽之間對產(chǎn)酶的影響效果不顯著。

圖10 鹽離子對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.10 Effect of salt ions on nattokinase activity of N-2 strain

對以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，初步確定較佳的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 6.0，加入適量Ca2+鹽，發(fā)酵溫度35 ℃。在此培養(yǎng)條件下使用N-2菌進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)酶，測得菌液的酶活為1365 U/mL。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)調(diào)味品中分離納豆激酶產(chǎn)生菌，對篩選出的幾株纖溶活性高的菌株進(jìn)行了納豆發(fā)酵，并對納豆進(jìn)行了評分比較。其中，N-2菌株各指標(biāo)綜合評價(jià)分值最高，該菌株發(fā)酵納豆性狀較優(yōu)。發(fā)酵初始pH及供氧對納豆激酶酶活影響極顯著?？赏ㄟ^改變培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基營養(yǎng)組成優(yōu)化產(chǎn)酶條件，提高納豆激酶酶活。另外，可通過誘變或基因工程方式對菌種進(jìn)行選育，提高納豆激酶產(chǎn)量。

市售納豆及納豆激酶存在的突出問題：大多市售納豆都有稍許胺臭味，有少部分人能接受食用；納豆和納豆激酶產(chǎn)品牽涉到納豆激酶酶活，其產(chǎn)品的貨架期相對其他調(diào)味品或保健品的貨架期短；菌株納豆激酶產(chǎn)量低。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的研究內(nèi)容主要從以下幾個(gè)方面著手，納豆發(fā)酵優(yōu)化、延長產(chǎn)品的貨架期和提高N-2菌株的產(chǎn)酶量等方面。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)豆豉中篩選出的納豆激酶產(chǎn)生菌編號為N-2的菌株，對其進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等項(xiàng)目的測定；鑒定結(jié)果初步認(rèn)定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。N-2菌株纖溶活性高，其納豆發(fā)酵性狀最佳，納豆拉絲長達(dá)80 cm，其酶活達(dá)到1159 U/mL，該菌最適的單因素液體發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH 6.0，添加0.02%濃度的 Ca2+鹽，發(fā)酵溫度35 ℃。在該條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，其酶活為1365 U/mL，酶活比之前提高了18%。解淀粉芽孢桿菌是公認(rèn)的益生菌，而且該菌株又來源于食品，因此，N-2菌株可用于保健豆豉和納豆的生產(chǎn)和開發(fā)，但作為納豆激酶生產(chǎn)菌商品開發(fā)，該菌株的酶活有待進(jìn)一步提高。