張寒玉，王 婷，唐 朝，馮光文，錢衛(wèi)東，蔡長(zhǎng)龍，毛培宏

(1.新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,離子束生物技術(shù)中心,新疆烏魯木齊830046;2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安710032;3.西安工業(yè)大學(xué)離子束生物工程與生物多樣性研究中心,陜西西安710032)

0 引言

低能離子注入到生物細(xì)胞內(nèi)，可參與細(xì)胞的生理、生化反應(yīng)，并影響生物的進(jìn)化，其相互作用是一個(gè)極為復(fù)雜的物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)過程[1,2]．低能離子注入生命體的方法和技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物和微生物的品種改良、生命起源與進(jìn)化、環(huán)境輻射與防護(hù)以及人類健康等領(lǐng)域[3?8]．

重復(fù)序列是真核生物基因組中的重要組成部分，主要分為串聯(lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列兩類[9]．基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列包括衛(wèi)星DNA[10]、小衛(wèi)星DNA[11]和微衛(wèi)星DNA[12]．其中，微衛(wèi)星DNA又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats,SSRs)，隨機(jī)分布于生物體整個(gè)基因組中，是目的基因篩選、基因診斷及其多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等工作的理想的分子遺傳標(biāo)記．而散在重復(fù)序列，即轉(zhuǎn)座子元件（Transposable Element,TE)，分為RNA轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子，不僅可以影響真核生物基因組的大小，還能直接或間接促成基因組重排，并影響基因表達(dá)水平、改寫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)．因此TEs在基因組的進(jìn)化中具有重要意義[13]．

異常漢遜酵母（Hansenula anomala）是一種重要的非釀酒酵母，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯生香能力，且在較高溫度的條件下具有較強(qiáng)的發(fā)酵力和酯化力，廣泛用于高品質(zhì)釀造食品的研發(fā)[14?18]．

本研究在全基因組de novo測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法分析低能離子注入對(duì)異常漢遜酵母菌基因組中各種重復(fù)序列的致突變分子信息，以期深入認(rèn)識(shí)低能離子注入對(duì)酵母菌基因組結(jié)構(gòu)特征的影響，并為異常漢遜酵母菌的分子育種及SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供理論依據(jù)，為開展異常漢遜酵母菌遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株及其全基因組De novo測(cè)序

異常漢遜酵母菌來源于陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院功能微生物研究室，常規(guī)方法傳代、培養(yǎng)，收集遺傳穩(wěn)定的純培養(yǎng)菌體．根據(jù)低能離子注入生命體產(chǎn)生的“反常輻照損傷”生物效應(yīng)的基本原理[1]，應(yīng)用能量15 KeV、劑量10×1015ions/cm2的Ar+注入異常漢遜酵母菌菌體，參照L¨u的方法[3]進(jìn)行離子注入后的菌體洗脫、分離、傳代、培養(yǎng)，獲得離子注入后的遺傳穩(wěn)定的純培養(yǎng)菌體．

采用常規(guī)方法分別制備離子注入前后的異常漢遜酵母菌基因組DNA，并應(yīng)用PacBio單分子測(cè)序技術(shù)分別對(duì)其進(jìn)行全基因組De nove測(cè)序，所獲得的全基因組DNA序列，作為本研究的基本數(shù)據(jù)．

1.2 基因組中重復(fù)序列的獲取

應(yīng)用TRF（Tandem Repeat Finder）方法（http://tandem.bu.edu/trf/trf404.linux64.download.html）來獲取離子注入前后的異常漢遜酵母菌全基因組DNA序列中的串聯(lián)重復(fù)序列，最大的重復(fù)單元bp數(shù)設(shè)置為2 000bp.

對(duì)TRF獲取的結(jié)果進(jìn)行細(xì)分，設(shè)置微衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位為2～6bp，小衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位為10～60bp．

使用RepeatMasker方法(http://www.repeatmasker.org/RMDownload.html)獲取離子注入前后的異常漢遜酵母菌全基因組DNA序列中的散在重復(fù)序列．

2 結(jié)果與分析

2.1 異常漢遜酵母菌基因組中微衛(wèi)星DNA序列的突變特征

利用TRF方法在低能離子注入前后的異常漢遜酵母菌基因組重復(fù)序列中各發(fā)現(xiàn)了175個(gè)SSR．雖然SSR數(shù)目沒有變化，但離子注入后，異常漢遜酵母菌基因組中SSR的總長(zhǎng)度從8 310bp減少到8 163 bp，SSR在基因組中的分布頻率從78.63Kb減少到77.98Kb．

在SSR的重復(fù)類型方面，離子注入后，異常漢遜酵母菌基因組SSR中的三堿基（Tri-）類型的數(shù)目從94條增加到97條，而四堿基（Tetra-）和五堿基（Penta-）類型分別減少了2條和1條．SSR在離子注入前后的異常漢遜酵母菌基因組中的分布如圖1所示．

在SSR的各種類型堿基重復(fù)基序方面，由于離子注入的作用，異常漢遜酵母菌基因組中SSR三堿基重復(fù)基序的GAG和ATC分別突變?yōu)锳GG和ATG．除ACC外，其它三堿基重復(fù)類型的數(shù)目均發(fā)生了變化．離子注入后，四堿基重復(fù)基序的GAAT和GTTG分別突變?yōu)镚TTA和TTCA，雖然GTTA的數(shù)目只有1條，但其累積長(zhǎng)度為128bp，占四堿基重復(fù)總長(zhǎng)度的18.85%，其它每種類型的四堿基重復(fù)基序的累積長(zhǎng)度范圍為25bp～27bp．而五堿基重復(fù)基序中，有9種類型重復(fù)基序發(fā)生了堿基突變．在六堿基重復(fù)基序中，突變的重復(fù)基序類型為28種，同時(shí)新增1種重復(fù)基序類型．離子注入前后，異常漢遜酵母菌基因組中SSR各堿基重復(fù)基序的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1．

圖1 離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中SSR的分布

表1 離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組微衛(wèi)星DNA各類型重復(fù)序列中重復(fù)基序分布

表1 續(xù)離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組微衛(wèi)星DNA各類型重復(fù)序列中重復(fù)基序分布

表1 續(xù)離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組微衛(wèi)星DNA各類型重復(fù)序列中重復(fù)基序分布

各種重復(fù)類型的拷貝數(shù)分析結(jié)果（表2）表明，異常漢遜酵母菌基因組微衛(wèi)星DNA序列均在低拷貝區(qū)出現(xiàn)頻率較高，離子注入前后，拷貝數(shù)低于15次的微衛(wèi)星序列占比最高，分別為75.43%和73.14%；其次是拷貝數(shù)在15～27之間的微衛(wèi)星序列，占比分別為17.14%和18.29%；拷貝數(shù)在27～39之間的占比分別6.86%和7.43%；拷貝數(shù)大于39次的微衛(wèi)星序列最少，僅占0.57%和1.14%，離子注入增加了高拷貝區(qū)的微衛(wèi)星序列數(shù)目．從五種重復(fù)類型的平均拷貝數(shù)來看，離子注入前后變化不大，如圖2所示．離子注入前的五種重復(fù)類型的平均拷貝數(shù)分別為33.00、15.04、12.76、7.33、8.51，離子注入后分別為33.00、15.43、13.11、8.00、8.44．

表2 離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中不同類型的微衛(wèi)星DNA序列拷貝數(shù)分布

圖2 離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中SSR五種重復(fù)類型的單元長(zhǎng)度與拷貝數(shù)的變化

2.2 異常漢遜酵母菌基因組中小衛(wèi)星DNA序列的突變特征

利用TRF方法在低能離子注入前后的異常漢遜酵母菌基因組的串聯(lián)重復(fù)序列中各發(fā)現(xiàn)小衛(wèi)星DNA序列1 384條和1 361條，總長(zhǎng)分別為79 849bp和74 362bp．由此可見，離子注入導(dǎo)致23條小衛(wèi)星DNA序列缺失，總長(zhǎng)度達(dá)5 487bp．

離子注入前，異常漢遜酵母菌基因組小衛(wèi)星DNA序列中，長(zhǎng)度為15bp的重復(fù)單位序列數(shù)目多達(dá)211條，占小衛(wèi)星序列總數(shù)的15.52%，其次是12bp（175條）、18bp（160條）、21bp（116條）、13bp（62條）和24bp（59條）；重復(fù)單元是15bp的序列累積長(zhǎng)度最長(zhǎng)，8 328bp，占小衛(wèi)星序列總長(zhǎng)的10.43%，其次是18bp（8 010bp）、12bp（7 507bp）；重復(fù)單元的拷貝數(shù)范圍分布最廣的前5種序列是：13bp（1.9～42.5）、12bp（2.1～36.5）、42bp(1.9～22.5)、21bp（1.9～18.5）、36bp（2.0～17.8）．

離子注入后，酵母菌基因組小衛(wèi)星DNA序列中，重復(fù)單位為15bp的序列數(shù)目雖然多達(dá)192條，但比離子注入前缺失了19條．除此之外，重復(fù)序列數(shù)目較多的前五位分別是12bp（175條）、18bp（165條）、21bp（111條）、13bp（60條）和20bp（60條），其中以18bp為重復(fù)單元的序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)，共計(jì)8 258bp，占小衛(wèi)星DNA序列總長(zhǎng)的11.11%．其次是重復(fù)單位為15bp的序列，總長(zhǎng)7 673bp；重復(fù)單位為12bp的序列，總長(zhǎng)7 132bp．重復(fù)單元的拷貝數(shù)范圍分布最廣的前5種序列分別是：12bp（2.1～20.7）、21bp（1.9～19.6）、36bp（2.0～17.4）、42bp（2.0～16.6）、24bp（1.9～13.0）．

與離子注入前相比，離子注入后的異常漢遜酵母菌基因組小衛(wèi)星DNA序列中缺失了重復(fù)單元為47bp和56bp的小衛(wèi)星DNA序列，新增了重復(fù)單元為35bp、58bp和59bp的小衛(wèi)星DNA序列．

異常漢遜酵母菌基因組中的小衛(wèi)星DNA序列數(shù)目與其重復(fù)單位長(zhǎng)度有一定關(guān)系，隨著重復(fù)單位長(zhǎng)度的增加呈下降趨勢(shì)，這一特征在重復(fù)單元大于15bp的小衛(wèi)星序列中尤為顯著；與微衛(wèi)星DNA序列類似，小衛(wèi)星DNA序列重復(fù)單位拷貝數(shù)較低，主要分布在1～3次；重復(fù)單元拷貝數(shù)與小衛(wèi)星序列之間無顯著的相關(guān)關(guān)系．

離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)類型數(shù)目、序列長(zhǎng)度及拷貝數(shù)的變化如圖3和圖4所示．

圖3 離子注入前后酵母菌基因組中小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)單元長(zhǎng)度與其數(shù)量的變化

圖4 離子注入前后酵母菌基因組中小衛(wèi)星DNA序列的重復(fù)單元長(zhǎng)度與其拷貝數(shù)的變化

2.3 異常漢遜酵母菌基因組中散在重復(fù)序列的突變特征

運(yùn)用RepeatMasker方法，獲得了離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中的多種散在重復(fù)序列（表3），其在基因組中占比僅為0.78%左右．離子注入前，長(zhǎng)末端重復(fù)DNA序列（LTR）數(shù)目最多，為695條，占總數(shù)的46.30%；其次是DNA轉(zhuǎn)座子，為459個(gè)；長(zhǎng)散在重復(fù)DNA序列（LINE）共303條；而短散在重復(fù)DNA序列（SINE）只有25條；滾環(huán)（RC）14個(gè)．

表3 離子注入前后異常漢遜酵母菌基因組中散在重復(fù)DNA序列的分布

離子注入后，異常漢遜酵母菌基因組中的LTR數(shù)目缺失了5條，DNA轉(zhuǎn)座子缺失了19個(gè)，LINE新增加了12條，RC缺失了1個(gè)，而SINE沒有變化．

3 討論

真核生物基因組中的重復(fù)序列對(duì)生物的進(jìn)化、遺傳和基因的表達(dá)與調(diào)控有重要作用．基因組中重復(fù)序列的出現(xiàn)，表明基因組DNA在不斷地進(jìn)行自我復(fù)制，并進(jìn)行水平交換和垂直交換，其重要作用是不斷豐富生物的遺傳信息[19]．生物體中許多關(guān)鍵基因是單拷貝的，重復(fù)序列的存在能保護(hù)這些重要的基因結(jié)構(gòu)不受破壞，同時(shí)重復(fù)序列也是新基因產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，是驅(qū)動(dòng)生物進(jìn)化的重要因素之一[20]．

低能離子注入對(duì)異常漢遜酵母菌基因組中的重復(fù)序列具有明顯的致突變效應(yīng)．微衛(wèi)星DNA序列和小衛(wèi)星DNA序列的總長(zhǎng)度分別缺失了147bp和5 487bp；多種類型的SSR的重復(fù)基序不僅發(fā)生了單堿基和多堿基突變，其數(shù)量和拷貝數(shù)也發(fā)生了不同程度的變化，其中優(yōu)勢(shì)三堿基重復(fù)基序AAC增加了2條，新增的GTTA和TTCA為離子注入后的獨(dú)具特征的SSR四堿基重復(fù)基序；離子注入使高拷貝區(qū)的SSR數(shù)目增加了1倍，并導(dǎo)致重復(fù)單元為47bp和56bp的小衛(wèi)星DNA序列缺失，同時(shí)新增了重復(fù)單元為35bp、58bp和59bp的三種小衛(wèi)星DNA序列．

對(duì)異常漢遜酵母菌基因組散在重復(fù)序列的分析發(fā)現(xiàn)，離子注入導(dǎo)致LTR缺失了5條、DNA轉(zhuǎn)座子缺失了19個(gè)、RC缺失了1個(gè)，而LINE新增加了12條，新增總長(zhǎng)度達(dá)1 568bp．

異常漢遜酵母菌基因組串聯(lián)重復(fù)序列中兩堿基重復(fù)序列數(shù)目最少，且僅有AT重復(fù)基序，在微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA中的含量均大于50%，這與全基因組DNA序列中AT含量較高有關(guān)．離子注入對(duì)AT重復(fù)基序沒有任何影響，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究．

異常漢遜酵母菌作為漢遜酵母屬中常見的一個(gè)種，具有一些釀酒酵母缺乏的釀造特性，是釀造產(chǎn)品香氣成分的主要貢獻(xiàn)者之一[21,22]，有助于最終產(chǎn)品感官特性的提高[23]，是高品質(zhì)釀造食品研發(fā)的特色酵母菌株之一，本研究結(jié)果為其分子育種提供了理論基礎(chǔ)，為其SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了豐富的DNA重復(fù)基序資源，也為后續(xù)開展其遺傳多樣性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)．

現(xiàn)有的研究證明了低能離子注入是驅(qū)動(dòng)微生物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化的重要因素之一[1,2,24]，本研究結(jié)果為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)低能離子注入對(duì)酵母菌基因組重復(fù)序列的生物學(xué)效應(yīng)及其基因表達(dá)與調(diào)控提供了素材，同時(shí)為低能離子注入介導(dǎo)的酵母菌基因組突變與進(jìn)化提供了分子證據(jù)．

致謝

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金(11575149和31760016)和陜西科技大學(xué)博士科研項(xiàng)目(126021759)資助．北京諾禾致源生物信息科技股份有限公司微生物事業(yè)部協(xié)助進(jìn)行了低能離子注入前后的異常漢遜酵母菌的全基因組de novo測(cè)序．