林潔 黃炳臣

【摘要】目的研究多種耐藥蛋白在三陰性乳腺癌中表達(dá)的臨床意義。方法采用免疫組化法檢測76例三陰性乳腺癌患者谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTπ）、P-糖蛋白（Pgp）、肺耐藥蛋白（LRP）和拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱ（TOPOⅡ）的表達(dá)，分析它們與患者的臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果三陰性乳腺癌患者中GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ的陽性表達(dá)率分別為63.16%、25.00%、34.21%、32.89%，GSTπ的高表達(dá)與脈管癌栓有相關(guān)性，而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級無相關(guān)性；TOPO Ⅱ的表達(dá)與患者的年齡有相關(guān)性，而與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及組織學(xué)分級無相關(guān)性；Pgp、LRP的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓和組織學(xué)分級均無相關(guān)性；GSTπ與LRP表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.393，P=0.003），其他基因表達(dá)水平間無相關(guān)性。結(jié)論GSTπ表達(dá)水平與三陰性乳腺癌臨床病理特征如血道轉(zhuǎn)移等相關(guān)，且GSTπ與LRP表達(dá)呈正相關(guān)，提示聯(lián)合檢測GSTπ和LRP在三陰性乳腺癌中的表達(dá)對判斷腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的參考價值。

【關(guān)鍵詞】三陰性乳腺癌；GSTπ；Pgp；LRP；TOPOⅡ；耐藥性

中圖分類號：R737.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.05.010

【Abstract】ObjectiveTo study the clinical significance of expression of multidrug resistance protein in triple-negative breast cancer.MethodsThe expressions of glutathione S-transferase （GSTπ），P-glycoprotein （Pgp），lung resistant protein（LRP） and topoisomerase Ⅱ （TOPO Ⅱ） in 76 patients with triple-negative breast cancer were detected by immunohistochemical method，and the correlation between them and clinicopathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rates of GSTπ，Pgp，LRP and TOPOⅡ in patients with triple-negative breast cancer were 63.16%，25.00%，34.21% and 32.89%，respectively.The high expression of GSTπ was correlated with vascular tumor thrombus，but not with age，tumor size and histological grade.The expression of TOPO Ⅱ was correlated with age，but not with tumor size，lymph node metastasis，vascular tumor thrombus and histological grade.The expressions of Pgp and LRP were not correlated with age，tumor size，lymph node metastasis，vascular tumor thrombus and histological grade.There was positive correlation between the expressions of GSTπ and LRP（r=0.393，P=0.003），but there was no correlation between other gene expression levels.ConclusionGSTπ expression level is associated with clinicopathological features of triple-negative breast cancer such as hematogenous metastasis，and GSTπ and LRP expression are positively correlated.These results suggest that the combined detection of GSTπ and LRP expressions in triple-negative breast cancer have certain reference value for judging tumor metastasis.

【Key words】triple-negative breast cancer；GSTπ；Pgp；LRP；TOPOⅡ；drug resistance

據(jù)2015年的數(shù)據(jù)顯示，我國乳腺癌的新發(fā)病率占全國新發(fā)腫瘤的15%[1]，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的首位[2]。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2/neu）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）及孕激素受體（Progesterone，PR）在乳腺浸潤性癌中均呈陰性表達(dá)。TNBC患者的發(fā)病率占乳腺癌患者的15.0%～23.8%，具有局部復(fù)發(fā)早，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對內(nèi)分泌治療無效，預(yù)后相對較差等臨床特點。針對其高度的異質(zhì)性，臨床上主要采用以化療為主的全身治療方法，因此對TNBC耐藥蛋白的研究非常重要。本實驗主要對谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTπ）、P-糖蛋白（Pgp）、肺耐藥蛋白（LRP）和拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱ（TOPOⅡ）在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。

1資料與方法

1.1一般資料收集2015～2017年右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腺體外科收治的并經(jīng)病理證實的三陰性乳腺癌標(biāo)本共76例，均為浸潤性，術(shù)前均未行抗腫瘤治療，患者均為女性，年齡28～65歲，其中非特殊型74例，化生性癌1例，黏液腺癌1例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，脈管內(nèi)有癌栓26例。

1.2研究方法應(yīng)用免疫組化法（SP法）檢測三陰性乳腺癌中GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ的表達(dá)情況，所使用的抗體試劑盒購于福州邁新公司；操作步驟嚴(yán)格按照說明書的方法依序進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)GSTπ陽性染色定位于細(xì)胞的胞漿或細(xì)胞核[3]，Pgp陽性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，LRP陽性染色定位于細(xì)胞漿，TOPOⅡ陽性染色定位于細(xì)胞核[4]。陽性染色強(qiáng)度以（+）表示，陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，10%～25%為（+），26%～75%為（++），>75%為（+++）；TOPOⅡ的陽性標(biāo)準(zhǔn)以級別表示，陽性腫瘤數(shù)<25%為Ⅰ級，25%～50%為Ⅱ級，51%～75%為Ⅲ級，>75%為Ⅴ級。GSTπ、Pgp和LRP≥（++），TOPOⅡ≤（+）具有診斷價值，表明腫瘤具有耐藥性[5]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，TNBC的臨床病理特征及四種耐藥蛋白的表達(dá)狀況的對比使用χ2 檢驗或確切概率法，采用Spearman描述分類變量的相關(guān)性，檢驗水準(zhǔn)：α=005，雙側(cè)檢驗。

2結(jié)果

2.1三陰性乳腺癌中GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ的表達(dá)GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ在TNBC中的陽性率分別為63.16%（48/76）、25.00%（19/76）、34.21%（26/76）、32.89%（25/76）。不同耐藥蛋白在TNBC中的陽性染色定位情況見圖1A～D。

2.276例TNBC中GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系76例TNBC患者中，脈管內(nèi)有癌栓的患者GSTπ的表達(dá)多于脈管內(nèi)無癌栓的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但與患者的年齡、腫瘤的直徑及腫瘤的組織學(xué)分級無相關(guān)性（P>0.05）；TOPOⅡ與患者的年齡有相關(guān)性（P<0.05），而與腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及腫瘤的組織學(xué)分級無關(guān)（P>0.05）；Pgp、LRP與患者年齡、腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及腫瘤的組織學(xué)分級均無相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

2.3GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示，GSTπ與LRP表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.393，P=0.003），其他基因表達(dá)水平間無相關(guān)性。見表2～4。

3討論

乳腺浸潤性癌為高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，而三陰性乳腺癌作為浸潤性癌中的一個分子類型，具有侵襲性強(qiáng)、易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)率高、死亡率高、預(yù)后差的生物行為特性[6]。有研究顯示[7]，影響TNBC生存的預(yù)測因子為患者的年齡、組織學(xué)分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，其中年齡是影響乳腺浸潤性癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。2011年，國際乳腺癌大會（St.Gallen）提出共識：將發(fā)病年齡小于或等于35歲作為乳腺癌患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素。本研究提示TNBC發(fā)病年齡為41歲，以浸潤性非特殊型為主的生物學(xué)特性，與某些研究結(jié)果一致[8]。TNBC出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高，是因為惡性腫瘤本身的惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，同時還和相關(guān)蛋白的表達(dá)關(guān)系十分緊密。GSTπ、Pgp、LRP和TOPOⅡ是乳腺癌中常見的四個相關(guān)耐藥蛋白。

GSTπ是一種多功能酶系，參與多種生理功能，通過催化降解腫瘤細(xì)胞中的藥物濃度來減弱化療藥物對腫瘤的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。當(dāng)前的研究指出GSTπ與順鉑、奧沙利鉑、阿霉素等藥物的耐藥性有關(guān)[9]。Pgp是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員，具有能量依賴型“藥泵”的功能，在所有腫瘤中都有過表達(dá)的表現(xiàn)，而其高表達(dá)將會導(dǎo)致腫瘤對幾種親脂類藥物產(chǎn)生耐受，特別是對生物堿類藥物具有高度耐受性[10]。Pgp在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，可將抗腫瘤藥物泵出細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，從而達(dá)不到預(yù)期的治療效果，同時還可通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性與外源性的凋亡途徑抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，降低藥效[11]。Hela細(xì)胞中因含有四環(huán)素抑制性質(zhì)粒系統(tǒng)，故Pgp的表達(dá)是關(guān)閉的，從而阻斷了Pgp轉(zhuǎn)運(yùn)活性，使腫瘤細(xì)胞對TRAIL（通過外源性凋亡途徑殺死腫瘤細(xì)胞）更加敏感，因此Pgp的表達(dá)是賦予TRAIL抗藥性的重要因素[12]。LRP是人穹窿主蛋白（MVP），一方面可阻止細(xì)胞核靶向藥物進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞核的藥物濃度降低而達(dá)不到預(yù)期的治療效果，另一面又可將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，以胞吐方式將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度。在某些腫瘤中LRP表達(dá)水平的高低可評估患者的預(yù)后和存活[13]。LRP16為macro domain家族成員之一，其可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TOPOⅡ是機(jī)體作用于核酸的關(guān)鍵酶，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中能使DNA雙鏈形成瞬間的缺口，若其被抑制或裂解，將會導(dǎo)致DNA雙鏈形成永久的缺口并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。它是抗轉(zhuǎn)錄藥物拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的主要靶點，TOPOⅡ與柔紅霉素、阿霉素等藥物的耐藥性相關(guān)[14]，所以TOPOⅡ的下調(diào)或功能的改變將會影響到治療的敏感性。臨床上將TOPOⅡ≤50%作為用藥的依據(jù)。

本研究中GSTπ在TNBC中高表達(dá)（63.16%），與孫晶波等[15]的研究結(jié)果一致，GSTπ的表達(dá)與脈管癌栓有相關(guān)性，脈管內(nèi)有癌栓患者的GSTπ的表達(dá)多于脈管內(nèi)無癌栓患者，與肖秀麗等[16]的研究結(jié)果一致。由此可說明癌組織的惡性程度較高，對化療藥物的反應(yīng)差，導(dǎo)致耐藥。Pgp與患者年齡、腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及腫瘤組織學(xué)分級均無相關(guān)性，與左文述等[17]的研究結(jié)果一致。 據(jù)文獻(xiàn)報道，LRP16在100例浸潤性導(dǎo)管癌中有33例表達(dá)，其表達(dá)水平與ER表達(dá)、腫瘤分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，而與患者的發(fā)病年齡、組織學(xué)分級、腫瘤的大小無關(guān)[18]。LRP16的表達(dá)提示患者的預(yù)后較差，與本實驗的結(jié)果不大相同，可能與本實驗的樣本例數(shù)較少或使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致有關(guān)。本實驗中TOPOⅡ≤50%為51例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明三陰性乳腺癌有可能對拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑有選擇性耐藥。本研究通過分析GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ間的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)GSTπ與LRP表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.393，P=0.003），其他基因表達(dá)水平間無相關(guān)性，說明它們的耐藥途徑和對藥物的敏感性有所不同。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ間的相關(guān)性，除了GSTπ與LRP表達(dá)呈正相關(guān)，其他基因表達(dá)水平間無相關(guān)性。說明它們在介導(dǎo)腫瘤耐藥性方面有各自的作用機(jī)制，但本研究結(jié)果提示它們之間可能存在某種協(xié)同或拮抗作用。因此下一步我們將擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)聯(lián)合檢測GSTπ、Pgp、LRP、TOPOⅡ在三陰性乳腺癌中的表達(dá)，為臨床選擇用藥方案提供重要的參考價值。

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（收稿日期：2018-03-21修回日期：2018-09-16）

（編輯：潘明志）