閆晉晉 楊薪正 姚妙 廖國(guó)珍

摘 要：目的：觀察黃芪總提取液對(duì)D-半乳糖致大鼠亞急性衰老模型的影響。方法：建立D-半乳糖致大鼠亞急性衰老模型，以Y型電迷宮檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力，分別采用黃嘌呤氧化酶法、TBA比色法測(cè)定大腦SOD活性和MDA含量、硝酸還原酶法測(cè)定大腦NO含量，觀察大鼠服用黃芪總提取液后以上指標(biāo)的變化。結(jié)果：與D-半乳糖模型組相比，黃芪總提取液的中、高劑量組可提高亞急性衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（P<0.05），增加D-半乳糖所致衰老模型大鼠大腦SOD活性、降低MDA含量（P<0.05）。各給藥組均起到降低腦組織NO含量，但無法恢復(fù)至正常水平。結(jié)論：黃芪提取液能改善D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠的多項(xiàng)體征，攝入適量黃芪總提取物可以明顯提高大鼠機(jī)體抗氧化、抗衰老能力，從而對(duì)D-半乳糖誘發(fā)的大鼠衰老起到延緩的效果。

關(guān)鍵詞：黃芪提取液；D-半乳糖；衰老；大鼠；學(xué)習(xí)記憶

中圖分類號(hào)：R339.38 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2018）28-0005-04

Abstract： Objective： To observe the effect of total extract of astragalus on subacute aging model of rats induced by D-galactose. Methods： The subacute aging model induced by D-galactose was established in rats. The ability of learning and memory was measured by Y-type electric maze. The activity of SOD and the content of MDA in brain were measured by xanthine oxidase method and TBA colorimetry， and the content of no in brain was determined by nitrate reductase method. The changes of the above indexes were observed after taking the total extract of astragalus membranaceus in rats. Results： Compared with D-galactose model group， middle and high doses of total extract of astragalus could improve the learning and memory ability of subacute aging model rats （P < 0.05）， increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in brain of aging model rats induced by D-galactose （P < 0.05）. The content of NO in brain tissue was decreased in each treatment group， but it could not recover to normal level. Conclusion： Astragalus membranaceus extract can improve many signs of subacute aging rats induced by D-galactose. Intake of appropriate amount of total extract of astragalus membranaceus can significantly improve the ability of anti-oxidation and anti-aging of rats. Thus D-galactose induced aging in rats play a delayed effect.

Keywords： astragalus membranaceus extract； D-galactose； aging； rat； learning and memory

黃芪是膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.或蒙古黃芪 （Astragalus membenanceus（Fisch.） Bge .Var干燥處理后的塊根，屬于豆科（Leguminosae）植物黃芪屬（Astragalus），文獻(xiàn)中記載原名為黃耆，最早發(fā)現(xiàn)載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用藥屬上品。中醫(yī)藥典籍《本草綱目》中稱：“耆，長(zhǎng)也，色黃者黃耆，乃補(bǔ)藥之長(zhǎng)”[1]。黃芪的功效有祛邪、扶正，歷來中醫(yī)當(dāng)“補(bǔ)氣固表之圣藥“使用。黃芪藥材中所含化學(xué)成分主要有黃酮類、多糖類、皂苷類以及多種氨基酸等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)研究表明，黃芪具有降壓利尿、抗衰老、增強(qiáng)人機(jī)免疫力、降血糖、抗疲勞、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、益智、抗病毒等作用。尤其近年來在現(xiàn)代藥理研究日趨成熟，黃芪新的功效及用途被源源不斷的發(fā)掘[2]。本研究旨在通過試驗(yàn)，觀察黃芪藥材總提取液對(duì)D-半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶、大腦中SOD活性、MDA及NO含量的影響，探討其抗衰老的作用機(jī)制，為黃芪進(jìn)一步開發(fā)成為抗衰老的天然植物源性藥物及為黃芪藥材的全方位綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可供參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

挑選成年Wistar實(shí)驗(yàn)大鼠80只，體質(zhì)健康，雌雄分半，體重均為310±15g，由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK（陜）2012-006。分4籠飼養(yǎng)，室溫保持在18～25℃，空氣濕度保持在40°，大鼠生活環(huán)境通風(fēng)良好，空氣新鮮，可自由活動(dòng)、取食、飲水。

1.2 藥品與試劑

黃芪提取液：實(shí)驗(yàn)用黃芪采自西北農(nóng)林科技大學(xué)藥用植物園，經(jīng)過廖國(guó)珍教授鑒定，取根部經(jīng)自然干燥，取黃芪根干品500g，置5000ml圓底燒瓶中，加開水3000ml在105℃下持續(xù)回流提取1.5h，抽濾，所剩殘?jiān)俅渭铀?000ml持續(xù)回流提取3次，每次1h，抽濾，合并所有濾液后濃縮，置真空干燥箱內(nèi)烘干，所得黃芪藥材總水提取物（1.3g生藥/ml）備用[2]。試驗(yàn)大鼠的灌胃體積采用0.4ml/20g的標(biāo)準(zhǔn)[3]。

六味地黃丸藥液的配制：采用北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠產(chǎn)品（批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993068）；購(gòu)于陜西省西安市 邑區(qū)秦渡鎮(zhèn)怡康藥店。將六味地黃丸5粒置研缽中研磨成細(xì)粉后加入超純水適量，配置成含六味地黃丸藥物濃度為0.165g/ml的混懸液，每周用前重新制備一次，在冰箱中4℃下保存，在使用前1h加熱至37℃?zhèn)溆谩?/p>

D-半乳糖（D-gal）：由上海生工生物工程有限公司進(jìn)口分裝；丙二醛（MDA）、超氧歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京市建成生物技術(shù)研究所（批號(hào)：20090726）。

2 方法

2.1 初步建立D-gal致亞急性大鼠衰老模型[4]

將雌雄各半的60只Wistar大鼠，隨機(jī)分為六組：（1）D-gal+黃芪提取液高劑量組；（2）D-gal+黃芪提取液中劑量組；（3）D-gal+黃芪提取液低劑量組；（4）D-gal+六味地黃丸藥物組；（5）D-gal空白組；（6）正常對(duì)照組。（1）、（2）、（3）、（4）、（5）五組采用D-gal致亞急性衰老法造成大鼠亞急性衰老模型。將D-gal 5000mg加于500ml生理鹽水中溶解，精確配制成濃度為10mg/ml的注射液，注射劑量設(shè)置為130mg/kg.d（即按大鼠每克體重注射0.0130ml D-gal注射液）在大鼠腹腔中部注射，（6）正常對(duì)照組使用等體積生理鹽水注射，6組大鼠采取每周稱重的方式，依據(jù)末次稱重的體重克數(shù)調(diào)整給藥劑量，連續(xù)造模8w。其中（1）D-gal+黃芪提取液高劑量組、（2）D-gal+黃芪提取液中劑量組、（3）D-gal+黃芪提取液低劑量組、（4）D-gal+六味地黃丸藥物組大鼠在第2周結(jié)束后分別灌胃給藥，規(guī)格為黃芪提取液0.5g/kg、0.25g/kg、0.1g/kg及六味地黃丸6.5mg/10g；（5）D-gal組大鼠以等量雙蒸水給藥；（6）正常對(duì)照組大鼠采用頸背部皮下注射的方式給予等量生理鹽水，并于第2周結(jié)束后給予等量雙蒸水，以此建立非模型常對(duì)照組。

2.2 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)-Y迷宮法[4]

將大鼠置于等方向輻射式反射箱（三向Y迷宮）。在大鼠被電擊后能快速逃跑至安全區(qū)規(guī)定為1次正確逃離反應(yīng)，每連續(xù)進(jìn)行10次測(cè)驗(yàn)中若有9次（90%）逃離反應(yīng)正確，則記錄為大鼠習(xí)得標(biāo)準(zhǔn)。記錄（6）正常對(duì)照組和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各試驗(yàn)組中每只大鼠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)所需的試驗(yàn)次數(shù)，用以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 測(cè)定大鼠腦組織中的SOD的活性

將試驗(yàn)結(jié)束后的大鼠迅速斷頭處死，獲取大腦組織并加入組織勻漿液在冰浴條件下勻漿，采用Bradfor D法準(zhǔn)確測(cè)定大鼠腦組織中總蛋白的含量。取濃度為1%的大鼠腦組織勻漿液，在波長(zhǎng)為545nm處選用黃嘌呤氧化酶法（ SOD檢測(cè)試劑盒）分別測(cè)定（6）正常對(duì)照組和（1）、（2）、（3）、（4）、（5）各試驗(yàn)組大鼠腦組織勻漿液的吸光度ASOD。

2.4 測(cè)定腦組織中MDA的含量

試驗(yàn)大鼠腦組織蛋白勻漿制備和定量方法均同2.3項(xiàng)下方法。于波長(zhǎng)534nm處，用TBA比色法（MDA檢測(cè)試劑盒）分別測(cè)定對(duì)照組和各試驗(yàn)組大鼠腦組織勻漿液的吸光度AMDA。

2.5 一氧化氮（NO）含量測(cè)定

（1）樣品的預(yù)處理。稱取100mg低溫凍存大腦皮質(zhì)組織，放入體積為0.9ml濃度為0.9% 的NaCl的試管內(nèi)，在電動(dòng)勻漿器內(nèi)運(yùn)行3min，制備成濃度為10%的組織勻漿，然后在離心機(jī)內(nèi)（3000r/min）離心15min，取上清液備用，采用硝酸還原酶法測(cè)定腦組織中NO的準(zhǔn)確含量。

（2）配制試劑。試劑盒內(nèi)7種試劑：試劑1、2在試驗(yàn)前置于37℃水浴中充分溶解；試劑3、4、7保存在室溫（25± 2℃）下；試劑5在試驗(yàn)前加入燒沸的雙蒸水20ml，充分溶解后在避光陰涼處保存；試劑6在試驗(yàn)前加入常溫雙蒸水8ml，充分混合后冷藏，并在避光條件下保存；顯色劑的配制比例為試劑5：6：7=3：1：1，避光條件下存儲(chǔ)；標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制，取0.1ml標(biāo)準(zhǔn)品，采用雙蒸水稀釋后定容至15 ml，混勻，即得。

（3）操作方法

混勻，25℃條件下陰涼避光放置10分鐘后用雙蒸水調(diào)零，在波長(zhǎng)545nm下采用1.0cm光徑，測(cè)定各組試劑的吸收度A。

根據(jù)以下公式計(jì)算腦組織中NO的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.00版本統(tǒng)計(jì)分析軟件，比較正常對(duì)照組與各試驗(yàn)組之間是否存在顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 黃芪藥材總提液對(duì)D-gal致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，在D-gal造模6周以后，模型組的大鼠達(dá)到習(xí)得標(biāo)準(zhǔn)所需要的訓(xùn)練次數(shù)呈現(xiàn)極顯著增加（P<0.01），而在黃芪總提取液中、高劑量組的大鼠達(dá)到習(xí)得標(biāo)準(zhǔn)所需要的訓(xùn)練次數(shù)呈現(xiàn)出顯著低于模型組（P<0.05）的態(tài)勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3.2 黃芪總提取液對(duì)D-gal所致衰老模型大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，在D-gal造模6周以后，模型組的大鼠腦組織中SOD的活性呈現(xiàn)出顯著降低的態(tài)勢(shì)（P<0.01），而腦組織中MDA的含量卻呈現(xiàn)出極顯著升高（P<0.01）的趨勢(shì)。在與模型組相比較的結(jié)果中顯示，黃芪總提取液中、高劑量均呈現(xiàn)出使大鼠腦組織中SOD活性顯著增加（P<0.05），而MDA的含量顯著降低（P<0.05）的趨勢(shì)。結(jié)果見表3。

3.3 黃芪提取液對(duì)D-gal致亞急性衰老大鼠腦組織NO的影響

表4的結(jié)果顯示：

（1）造模6周后，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，大鼠腦組織中NO的含量存在極顯著差異（P<0.01），各不同劑量給藥組與模型對(duì)照組比較，試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。

（2）各不同劑量給藥組與空白對(duì)照組相比較，各組均呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。

（3）黃芪總提取液低、中、高各劑量組之間的藥效作用大體無差別，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示為無差異（P>0.05）。

以上結(jié)果提示我們，對(duì)于D-gal致衰老的大鼠腦組織中NO含量的升高，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各不同劑量給藥組均起到了降低NO的作用，但尚未恢復(fù)至健康大鼠的正常水平。黃芪總提取液低、中、高各不同劑量組之間的藥效無顯著性差異，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的改進(jìn)不需要再增加或減少劑量，而黃芪總提取液對(duì)NO含量的降低功效很可能是藥物發(fā)揮抗衰老機(jī)制的重要途徑之一。

4 討論

關(guān)于衰老的學(xué)說，學(xué)術(shù)界尚未達(dá)成共識(shí)，其中自由基致衰老學(xué)說的觀點(diǎn)認(rèn)為新陳代謝是一切生命現(xiàn)象的本質(zhì)和基礎(chǔ)，衰老是生命有機(jī)體發(fā)生代謝性障礙導(dǎo)致的結(jié)果。糖代謝的紊亂會(huì)誘發(fā)心、肝、腦、腎等臟器代謝異常，導(dǎo)致生命走向衰老[5]。據(jù)此理論，我們?cè)O(shè)計(jì)了動(dòng)物衰老模型，即在一定的時(shí)間段內(nèi)持續(xù)給試驗(yàn)動(dòng)物大鼠注射一定劑量的D-gal，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的D-gal濃度在規(guī)定時(shí)間內(nèi)持續(xù)升高，最終D-gal在醛糖還原酶的作用下，生成還原產(chǎn)物半乳糖醇，半乳糖醇在細(xì)胞內(nèi)不能被正常代謝而富集起來，使細(xì)胞滲透壓增加，體積發(fā)生膨脹，從而出現(xiàn)功能障礙、代謝紊亂的現(xiàn)象，此外，生命有機(jī)體還呈現(xiàn)出多種抗氧化酶活性下降，機(jī)體抗氧化能力降低，大量的活性氧、自由基產(chǎn)生，伴隨這一過程的現(xiàn)象還有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，過氧化脂質(zhì)及脂褐素升高，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老現(xiàn)象的發(fā)生。試驗(yàn)表明，用D-gal注射建立亞急性衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低、活性氧和自由基產(chǎn)物增多、抗氧化降低、免疫力下降，可用于動(dòng)物行為學(xué)、抗氧化能力以及免疫學(xué)等學(xué)說的抗衰老藥物效果研究。本實(shí)驗(yàn)采用D-gal注射制備的亞急性衰老大鼠模型結(jié)果也顯示，D-gal造模后，大鼠的免疫器官開始萎縮，經(jīng)過測(cè)量，血清總蛋白和白蛋白含量下降，腦組織中NO含量上升，充分證明造模大鼠的癥狀為免疫力明顯下降。

生物有機(jī)體在新陳代謝過程中會(huì)持續(xù)的產(chǎn)生多種具有強(qiáng)氧化能力的自由基和活性氧，當(dāng)富集在細(xì)胞內(nèi)的自由基數(shù)量超出機(jī)體自身的清除能力時(shí)，自由基會(huì)誘發(fā)一系列的的氧化還原反應(yīng)，從而直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)受損以及新的交聯(lián)鍵的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的酶活性降低、引起DNA鏈非正常斷裂、活性多糖被降解、導(dǎo)致機(jī)體正常代謝被破壞，表現(xiàn)為各種疾病，同時(shí)加速機(jī)體衰老，皮膚光澤度下降、老年斑、皺紋等體征開始出現(xiàn)，對(duì)機(jī)體造成極大的傷害。根據(jù)D-gal致衰老造模是根據(jù)衰老的代謝學(xué)說而制備的一種典型衰老模型，它具有的自由基代謝紊亂特征與自然衰老非常相似，在學(xué)術(shù)界認(rèn)為該模型導(dǎo)致的衰老與自然衰老接近[5]。大量的D-gal進(jìn)入體內(nèi)后，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成具有強(qiáng)氧化性的自由基，自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞膜上的過氧化脂質(zhì)（LPO）的分解，產(chǎn)生的丙二醛（MDA）與DNA、RNA及蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜組份發(fā)生變化、功能發(fā)生障礙，促進(jìn)生命機(jī)體走向衰老[7]。除此之外，脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA還可引起機(jī)體精神行為變化，通過化學(xué)鍵交聯(lián)、結(jié)合生成脂褐質(zhì)，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生功能障礙。近年來，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示[6]，腦組織中MDA的含量隨年齡的增加而上升，SOD活性隨年齡的增長(zhǎng)而下降。SOD在機(jī)體代謝中的重要性體現(xiàn)在對(duì)保護(hù)機(jī)體心腦功能、延緩衰老方面具有不可忽視的作用。機(jī)體內(nèi)SOD的活性與生命的長(zhǎng)度呈現(xiàn)正相關(guān)[8]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)D-gal注射造模后的大鼠學(xué)習(xí)記憶力顯著降低、腦組織中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增高，表現(xiàn)出明顯的生命衰老體征；造模前后對(duì)比，D-gal致衰老模型的大鼠腦組織中NO含量顯著高于空白對(duì)照組的含量，黃芪總提取物低、中、高不同劑量對(duì)NO含量有一定程度的降低作用，但各劑量組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步正面黃芪總提取物很有可能是通過抑制組織內(nèi)NO的升高而產(chǎn)生增強(qiáng)生命機(jī)體免疫力的功效。

本研究結(jié)果表明，黃芪總提取液可導(dǎo)致D-gal 致衰老模型大鼠的衰老指征發(fā)生改變，學(xué)習(xí)記憶能力提高，SOD活性升高，MDA、NO含量降低。綜上，黃芪總提取液具有延緩生命機(jī)體衰老的功效，可為開發(fā)防神經(jīng)退行性病變、抗機(jī)體衰老的植物源性藥物提供一定的參考。

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