魯斌，俞廣進，程敏

(1安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院，合肥 238000；2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)

我國是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國家，每年新發(fā)病例約40萬人，約占全球新確診病例的一半左右，死亡人數(shù)超過30萬，病死率高居第二位[1]。即使患者接受了外科手術(shù)、其他抗腫瘤手段結(jié)合的綜合治療方案，仍無法有效防止復發(fā)，直徑5 cm以下的原發(fā)性肝癌患者術(shù)后3年的復發(fā)率超過50%[2]。上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指特定情況下上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，一般認為能使上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得并增強遷移和侵襲能力[3]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、緊密連接蛋白(Claudin)-3是EMT相關(guān)的兩種基因，在肝癌中的研究報道較少。2013年1月～2018年3月，我們觀察了原發(fā)性肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2016年6月安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院肝膽外科、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽胰一病區(qū)行肝葉切除、肝段切除術(shù)的原發(fā)性肝細胞癌患者85例，男71例、女14例，年齡<65歲41例，65歲以上44例。均經(jīng)病理科確診為原發(fā)性肝癌，其中腫瘤直徑<5 cm 70例，≥5 cm 15例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期51例，Ⅲ期30例；腫瘤微血管侵襲58例；肝硬化31例。納入標準：①經(jīng)病理科確診為原發(fā)性肝癌；②患者病歷、隨訪資料完整，組織蠟塊標本保存完好；③未合并其他惡性腫瘤；③未合并其他影響免疫組化結(jié)果的嚴重疾病。手術(shù)中于腫瘤病灶中心切取肝癌組織，另切取相應距離腫瘤邊緣5 cm以上非腫瘤組織中癌旁組織作為對照。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 不同肝組織中Snail、Claudin-3蛋白表達檢測 采用免疫組化法。將石蠟標本以4 μm間隔連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化。以3%H2O2浸泡孵育15 min，PBS沖洗3×3 min。在枸櫞酸緩沖液中，于高溫高壓修復抗原約90 s，冷卻后，PBS沖洗3×3 min。滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫放置20 min。滴加一抗(鼠抗人Snail單克隆抗體、鼠抗人Claudin-3單克隆抗體，均購自美國Santa Cruz公司)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3×3 min。滴加二抗(羊抗鼠IgG抗體，賽默飛世爾科技公司)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3×3 min。滴加鏈霉親和素-生物素復合物，室溫反應20 min，PBS沖洗3×3 min。DAB顯色，蘇木素復染。梯度乙醇脫水，常規(guī)裝片、封片。

Snail蛋白染色主要定位于細胞膜，亦可見于胞質(zhì)，Claudin-3蛋白染色定位于細胞質(zhì)。取400倍光學高倍鏡(×400)下4個視野，每個視野至少含有100個細胞。染色結(jié)果判定分為兩步：①染色強度計分：無染色計0分，淡黃色計1分，黃色至黃棕色計2分，褐色計3分；②染色數(shù)目計分：染色細胞<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。各視野染色評分為強度計分×數(shù)目計分，最終結(jié)果取各視野評分的算術(shù)平均數(shù)，≤2分為表達陰性，>2分則為表達陽性。

1.3 隨訪 以患者術(shù)后出院為觀察起點，應用電話、電子通訊等手段，對患者及家屬進行隨訪。隨訪截止于2018年3月，隨訪時間9～66(30.76±14.77)個月，中位隨訪時間為28個月。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性檢驗采用Spearman等級檢驗?；颊哳A后評估應用Kaplan-Meier生存曲線法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝組織中Snail、Claudin-3蛋白表達比較 肝癌、癌旁組織中Snail蛋白陽性表達率分別為69.41%(59/85)、36.47%(31/85)，Claudin-3蛋白陽性表達率分別為47.06%(40/85)、78.82%(40/85)，二者比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2分別為18.511、18.385，P均=0.000)。

2.2 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達與患者TNM分期、微血管侵襲相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、肝硬化無關(guān)(P均>0.05)。

2.3 肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達的關(guān)系 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達均陰性3例，均陽性17例，Snail表達陽性、Claudin-3表達陰性42例，Snail表達陰性、Claudin-3表達陽性23例，Spearman等級檢驗結(jié)果顯示，肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達呈負相關(guān)(r=-0.551，P=0.000)。

2.4 肝癌組織中Snail蛋白表達與患者預后的關(guān)系 肝癌組織中Snail表達陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線見圖1。肝癌組織中Snail蛋白表達陰性者術(shù)后生存率為42.31%(11/26)，術(shù)后生存時間為(40.75±3.44)個月；肝癌組織中Snail蛋白表達陽性者術(shù)后生存率為20.34%(12/59)，術(shù)后生存時間為(31.12±2.19)個月，肝癌組織中Snail蛋白表達陰性者術(shù)后生存率高于、生存時間長于表達陽性者(t=15.556,P=0.000;χ2=4.413,P=0.036)。

表1 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

圖1 肝癌組織中Snail表達陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線

2.5 肝癌組織中Claudin-3蛋白表達與患者預后的關(guān)系 肝癌組織中Claudin-3表達陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線見圖2。肝癌組織中Claudin-3蛋白表達陰性者術(shù)后生存率為17.78%(8/45)，術(shù)后生存時間(30.11±2.58)個月；肝癌組織中Claudin-3蛋白表達陽性者術(shù)后生存率為37.50%(15/40)，術(shù)后生存時間(40.10±3.02)個月， 肝癌組織中Claudin-3蛋白表達陰性者術(shù)后生存率低于、生存時間短于表達陽性者(t=16.446,P=0.000;χ2=4.173,P=0.041)。

3 討論

肝臟是人體功能最復雜的器官，生理病理進程豐富，因此原發(fā)于肝臟的疾病影響因素多，機制復雜。細胞微環(huán)境指細胞及其周圍組織所組成的內(nèi)環(huán)境，有別于存在動態(tài)平衡的正常微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境則是隨著腫瘤病情的進展，腫瘤細胞不斷打破平衡并發(fā)生惡性循環(huán)[4]。其中，影響較大的即腫瘤細胞EMT進程。EMT可表現(xiàn)為細胞間連接松動、胞內(nèi)骨架蛋白結(jié)構(gòu)變化、細胞極性喪失，是細胞獲得遷移能力的重要起始生物學過程[5]。生理狀態(tài)下如胚胎發(fā)育過程中亦會有EMT發(fā)生，但EMT更常見于腫瘤轉(zhuǎn)移進程。腫瘤細胞發(fā)生EMT后，伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶分泌增加，微環(huán)境基質(zhì)加速降解，腫瘤細胞得以進入脈管系統(tǒng)，從而能轉(zhuǎn)移并種植于其他臟器以形成轉(zhuǎn)移瘤[5]。因此EMT對于促進腫瘤細胞的侵襲力至關(guān)重要。

圖2 肝癌組織中Claudin-3表達陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線

Snail屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子，定位于人染色體20q13.13，能與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)啟動子區(qū)域結(jié)合，競爭性抑制Smad相互作用蛋白1(SIP1)，從而抑制E-cadherin、封閉蛋白(Occludin)及Claudin等蛋白表達，同時上調(diào)肝臟成纖維細胞特異蛋白(FSP1)、Rho蛋白、波形蛋白(Vimentin)等表達，影響細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，引起細胞骨架重組，最終誘導EMT發(fā)生[6]。近年研究表明，Snail蛋白在常見惡性腫瘤如卵巢癌[7]、結(jié)直腸癌[8]及罕見惡性腫瘤如胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[9]中均呈異常高表達，且均發(fā)揮促進腫瘤細胞遷移、增強腫瘤細胞侵襲力的作用。沉默Snail基因則能抑制腫瘤細胞EMT，進而抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白在原發(fā)性肝癌組織中表達較非腫瘤癌旁組織中上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，且與臨床分期、微血管侵襲密切相關(guān)，提示Snail能促進腫瘤的遷移與侵襲。

目前已發(fā)現(xiàn)24種Claudin蛋白家族成員，其相對分子質(zhì)量為22～27 kD，均是細胞間緊密連接的主要跨膜結(jié)構(gòu)蛋白。Claudin蛋白直徑作用于緊密連接膜相關(guān)蛋白的鳥苷酸激酶(GUK)同工酶、外周膜蛋白ZOs及富PDZ的蛋白1(MUPP-1)，且對菌環(huán)蛋白及肌動蛋白絲結(jié)合蛋白6(AF-6)亦有間接作用，從而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導，以參與細胞屏障的選擇性滲透并維持柵欄功能[11]。Che等[12]發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織中Claudin-3蛋白表達下降，且Claudin-3蛋白低表達與患者較差的預后、腫瘤細胞EMT增加密切相關(guān)；Kolokytha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腺管狀乳腺癌組織中Claudin-3蛋白表達陽性患者組術(shù)后無復發(fā)的生存期較對照組顯著延長，提示Claudin-3蛋白參與抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的陽性表達率較非腫瘤癌旁組織中低，差異有統(tǒng)計學意義，且與臨床病理分期、微血管侵襲密切相關(guān)，因此Claudin-3蛋白表達改變與原發(fā)性肝癌產(chǎn)生相關(guān)，且能抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。

李娟等[14]臨床研究顯示，非小細胞肺癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達呈顯著負相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達呈顯著負相關(guān)，推測原發(fā)性肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白間的作用機制很可能與非小細胞肺癌中類似，但仍需進一步實驗證實。

本研究隨訪結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白表達陽性者術(shù)后生存時間短于、生存率低于表達陰性者，Claudin-3蛋白表達陰性者術(shù)后生存時間短于、生存率低于表達陽性者，因此對于免疫組化結(jié)果如上述的患者，應高度重視復診與隨訪，適當加強治療手段的強度，以延長患者術(shù)后生存時間，提高患者術(shù)后生存率。

綜上所述，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白呈異常高表達，Claudin-3蛋白呈異常低表達，且與患者臨床表現(xiàn)、預后密切相關(guān)，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白與Claudin-3蛋白表達呈負相關(guān)；二者表達改變可能與肝癌發(fā)生與惡性進展有關(guān)，臨床有望作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標記物。