高月鋒，楊宇澤，簡路洋，蘆 偉，曲揚華，羅海玲*

（1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

睪丸內細胞類型眾多，可以分為生殖細胞和體細胞兩大類。生殖細胞依照動物的發(fā)育階段分為精原干細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子細胞和成熟精子。體細胞分為間質細胞、支持細胞、管周肌樣細胞、淋巴內皮細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞以及神經細胞[1]。近幾年，雄性繁殖相關的研究從針對睪丸質量以及組織形態(tài)學的研究轉移到細胞水平。

miRNAs是一類約為22 nt的短鏈非編碼RNA[2]。編碼miRNAs的基因通常位于基因間、外顯子或內含子區(qū)域[3]，miRNAs可與Argonaute（AGO）蛋白結合，形成RNA誘導沉默復合物（RⅠSC），RNA誘導沉默復合物中的miRNA的種子序列（大約2～7 nt）可與靶基因mRNA 3' UTR區(qū)域不完全互補配對，或通過降低靶基因mRNA，抑制其翻譯。部分研究表明，miRNAs可直接作用于靶基因序列，影響基因表達。同一個miRNA可以調控不同的靶基因，多個miRNAs也可以同時調控同一個靶基因[4]。miRNAs對睪丸的精子發(fā)生[5]及間質細胞[6]、支持細胞[7]和生殖細胞[8]的功能都起到重要的調控作用。本文綜述了近年來miRNAs對睪丸內間質細胞、支持細胞以及生殖細胞功能調控的研究進展，以期為本領域的研究者提供參考。

1 間質細胞

間質細胞位于睪丸的間質空間，主要作用是分泌類固醇激素睪酮。睪酮分泌主要受促黃體素（LH）調控。睪酮作用于支持細胞的雄激素受體[9]，從而影響支持細胞的功能。當睪酮分泌終止，會造成生殖細胞從支持細胞分離，最終導致生殖細胞死亡[10]。部分研究表明，miRNAs與間質細胞有直接或者間接的聯(lián)系。miRNA-125a和miRNA-455可以靶向受體SRBⅠ，降低類固醇激素的生成[11]。成纖維細胞生長因子（bFGF）可以顯著下調和上調早期間質細胞內miR-142-3p和miR-335的表達[12]。敲除miRNAs-140-5p/3p的胚胎，間質細胞數(shù)量明顯增加[6]。以上研究表明，miRNAs可能間接影響間質細胞的功能。

但miRNAs與間質細胞功能的直接研究卻少有報道。類固醇急性調節(jié)蛋白（STAR）可將類固醇由線粒體外膜轉移至內膜，此過程是類固醇激素合成的限速步驟。miRNA-150通過抑制STAR在mRNA及蛋白水平的表達，降低睪酮及其前體物的合成，最終影響精子的發(fā)生[13]。綜合以上研究結果，miRNAs也許可以調控間質細胞的數(shù)量以及能夠調控睪酮的分泌。miRNAs對間質細胞更多的調控作用還有待進一步挖掘。

2 支持細胞

2.1 支持細胞Dicer特異性敲除 支持細胞為精子的成熟提供支持、營養(yǎng)和保護作用。眾多研究結果表明，特異性敲除支持細胞內miRNAs合成關鍵酶Dicer，發(fā)現(xiàn)miRNAs與支持細胞的功能及精子發(fā)生有密切關系。Papaioannou 等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠支持細胞Dicer缺失造成睪丸退化和精子缺失，最終造成不育。Kim等[15]通過雜交獲得了支持細胞Dicer特異性缺失的小鼠，胚胎期胚胎發(fā)育正常；在產后第0天，曲細精管的數(shù)量和形態(tài)并未表現(xiàn)出異常，但與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生及結構完整性相關的基因表達皆下調；在產后第3天表現(xiàn)出大量的凋亡，造成生殖細胞和支持細胞缺失，以及睪丸尺寸降低；在產后第6天，表現(xiàn)出曲細精管數(shù)量降低及不育的癥狀[15]。Papaioannou等[16]研究結果表明，支持細胞Dicer缺失會使得睪丸內蛋白表達譜發(fā)生變化，Cu/Zn -SOD-1上調，因細胞凋亡而發(fā)生的細胞死亡增多。雖然以上試驗并未對miRNAs與支持細胞的直接功能進行研究，但Dicer是細胞合成miRNAs的關鍵酶之一，Dicer特異性缺失，睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生相繼受到不同程度的影響，可以間接說明miRNAs或許對支持細胞功能行使和精子發(fā)生具有重要的調控作用。

2.2 支持細胞增殖和凋亡 生殖細胞增殖和分化期間需依托于支持細胞。支持細胞的數(shù)量可在一定程度上決定生殖細胞的數(shù)量。多數(shù)物種的支持細胞的增殖發(fā)生在青春期前[17-19]，但魚類和兩棲類在性成熟后也會發(fā)生增殖[20]。支持細胞的增殖受多種因素調控，包括FSH、類固醇激素、雄激素和甲狀腺激素和生長因子（如胰島素樣生長因子）[19,21-22]。

支持細胞的增殖同樣也受到多種miRNAs的調控。Zhang等[23]研究表明，17β-雌二醇通過抑制miR-1285表達，從而激活AMPK來降低支持細胞的增殖。磷酸化的AMPK可通過增加p53和p27表達以及抑制mTOR和Skp2表達參與調節(jié)17β-雌二醇介導的支持細胞活力的抑制。此外，miR-133b可以靶向GLⅠ3，下調其表達，并促進支持細胞的增殖[7]。miR-762可促進豬未成熟支持細胞的增殖并抑制細胞凋亡，主要通過靶向結合RNF4的3'UTR區(qū)域，下調該基因的表達。RNF4是一種核轉錄因子，可作為雄激素受體依賴性轉錄中的共激活因子，降低的RNF4表達削弱了雄激素受體的轉錄調節(jié)活性[24]。以上研究結果說明，miRNAs可對支持細胞的活力、增殖和凋亡起到調控作用。

3 生殖細胞

3.1 生殖細胞Dicer特異性敲除 生殖細胞是繁殖功能的直接執(zhí)行者，生殖細胞與miRNAs間的研究日益增多。當特異性敲除小鼠原始生殖細胞和精原細胞內的Dicer，原始生殖細胞和精原細胞表現(xiàn)出增殖能力下降[8]。此外，生殖細胞Dicer1的特異性敲除造成曲細精管內很少出現(xiàn)成熟精子，分化的成熟精子也表現(xiàn)出形態(tài)異常和活力低下，僅少數(shù)缺乏Dicer1的精子能夠和野生型小鼠的卵子結合，生成后代[25]。

敲除Dicer也會造成睪丸尺寸的降低和精子發(fā)生過程的紊亂，造成附睪內成熟精子數(shù)量降低，精子形態(tài)異常，但精原細胞分化似乎未被影響，敲除后的睪丸中單倍體細胞的數(shù)量減少，凋亡的精母細胞數(shù)量增加。在晚期單倍體分化中發(fā)現(xiàn)明顯的缺陷[26]。在雄性生殖細胞發(fā)育的開端選擇性敲除Dicer1，由于減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后期的多重累積性缺陷，導致功能性精子缺乏，表現(xiàn)出不育的癥狀。同時，精母細胞到前期Ⅰ過程發(fā)生推遲，凋亡率增加，圓形精子細胞數(shù)量降低。從圓形到成熟精子的過渡過程也受到嚴重影響，在突變體中形成的少數(shù)精子不動且畸形，表現(xiàn)出精子頭部和鞭毛的形態(tài)缺陷，并且 Sine家族轉座因子的表達在Dicer1缺失的精母細胞中上調[27]。綜上所述，生殖細胞Dicer的特異性敲除可造成睪丸尺寸降低以及生殖細胞的數(shù)量、形態(tài)和功能的異常，間接說明了miRNAs或許對生殖細胞功能具有重要的調控作用。

3.2 生殖細胞更新及分化 精原干細胞的自我更新能力是生殖細胞行使生殖功能的基礎。通過自我更新，精原干細胞能夠保持數(shù)量的穩(wěn)定。精原干細胞的更新受到間質細胞以及支持細胞分泌的信號分子的調控，同時也受到其自身miRNAs的調控。研究表明，miR-21、miR-34c、miR-182、miR-183和miR-146a主要在精原干細胞內表達[28]。在研究中通過抑制miR-21的表達，發(fā)現(xiàn)凋亡的生殖細胞數(shù)量增多，將供體來源的細胞移植到受體后，供體來源的細胞集落數(shù)量顯著降低，并發(fā)現(xiàn)控制生殖干細胞自我更新的轉錄因子ETV5可調控miR-21的表達，說明miR-21在精原干細胞更新及精子發(fā)生過程中的重要作用[28]。He等[29]研究表明，miR-20和miR-106a主要在精原干細胞內表達，并可通過作用于STAT3和Ccnd1基因調控精原干細胞的自我更新。miR-184的表達限于從精原細胞到圓形的生殖細胞精子細胞。miR-184的過表達促進生殖細胞系GC-1spg的增殖，它可通過作用于NCOR2的 3' UTR，抑制NCOR2蛋白的表達。因此，miR-184對精子發(fā)生的調控或許通過NCOR2基因[30]。Liang等[31]研究表明，miR-34c可以在轉錄后水平，抑制ATF1在蛋白水平的表達，促進GC-2生殖細胞凋亡過程。以上研究結果進一步說明，miRNAs作為重要的調控因子對生殖細胞的更新起到調控作用。

精子發(fā)生需經歷由精原細胞向精母細胞的過渡階段，此階段同樣受到許多miRNAs的調控作用。McⅠver等[32]研 究 表 明，miR-293、miR-291a-5p、miR-290-5p、miR-294、miR-136、miR-743a 和 miR-463 在精原細胞分化成精母細胞的過程中起到至關重要的作用，這些miRNAs主要參與PTEN和Wnt信號通路，并發(fā)現(xiàn)關鍵的細胞周期調控因子Cyclin D1也是重要的靶基因之一。Luo等[33]利用高通量測序技術研究了B型精原細胞和精母細胞中miRNAs的表達譜，結果表明2種類型的細胞中Let-7家族miRNA的表達水平都非常高。在從精原細胞向精母細胞分化期間，miR-21、miR-140-3p、miR-103、miR-30a、miR-101和 miR-99b的表達水平降低，這些miRNAs靶向參與細胞凋亡、細胞增殖和分化、細胞連接形成和細胞周期調控的重要基因[33]。

3.3 染色質重塑 精子發(fā)生過程中會發(fā)生染色質重塑，染色質中的組蛋白會演變成過渡蛋白，最終演變成魚精蛋白。最近研究表明，miR-122a可以通過降解miRNA的轉錄本，抑制蛋白Tnp2的表達，Tnp2作為一種過渡蛋白，主要參與精子染色質重塑過程，對精子由精原細胞向成熟精子分化起到重要作用[34]。以上研究說明，miRNAs或許可以調控精子染色質重塑過程。

4 miRNAs對睪丸內細胞功能調控

睪丸內間質細胞、支持細胞和生殖細胞作為睪丸內行使繁殖功能的主要細胞類群，完成各自功能的同時受到自身多種miRNAs的調控。睪丸各細胞內表達的miRNA、下游靶基因及行使的功能總結見表1。

5 結 論

miRNAs可以影響間質細胞的數(shù)量及睪酮合成、調控支持細胞的增殖和凋亡以及生殖細胞的細胞周期、凋亡和染色質重塑，最終影響精子的發(fā)生過程。但有關miRNAs作用于睪丸細胞內的許多研究結果都局限于候選miRNAs及下游靶基因的識別，后續(xù)需要研究miRNAs在各細胞信號通路中起到的作用，更詳盡地揭示miRNAs對睪丸細胞的作用機制。

表1 睪丸各細胞內miRNAs的表達及功能