申越 賀麗 李華 陳璟若 徐碩 趙玉華

(四川大學 1.華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院人體解剖學教研室,2.華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室, 3.華西藥學院微生物與生化藥學教研室，四川 成都 610041)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。2012年，全世界女性乳腺癌新增病例170萬，占所有癌癥新增病例的25%；死亡約52萬例，占女性癌癥死亡率的15%。 表皮生長因子受體2(epidermal growth factor receptor 2，ErbB2)又稱為Her2或neu，是表皮生長因子受體家族的成員之一，也是臨床治療乳腺癌的重要靶點。在20%～25%的乳腺癌患者中ErbB2高表達，目前已公認ErbB2的高表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，并可作為檢測乳腺癌預后情況及長期生存率的獨立指標。大量的研究報道ErbB2的高表達可促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[4-8]。

1930年，Otto Warburg發(fā)現(xiàn)了瓦博格效應，即在供養(yǎng)充足的條件下，肝癌組織的糖酵解代謝明顯強于癌旁組織。糖酵解增強已成為惡性腫瘤細胞的一個顯著特征，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10]。2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglu- cose, 2-DG)是一種合成的葡萄糖類似物，抑制糖酵解的限速酶己糖激酶II(hexokinae kinase II, HKII)，能選擇性抑制腫瘤，目前已進入Ⅰ期臨床試驗階段[11-12]。已有研究報道，2-DG不僅能抑制霍奇金淋巴瘤[13]、結直腸癌[14-15]、胰腺癌[16]、卵巢癌和頭頸癌細胞[17]的增殖，還能抑制骨肉瘤和ErbB2陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲[18]。在小鼠模型中2-DG可抑制肺癌和急性髓細胞樣白血病的腫瘤生長[19- 20]以及骨肉瘤的轉(zhuǎn)移[18]。但2-DG對ErbB2高表達乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響目前國內(nèi)外尚未見報道。

前期研究結果證明，ErbB2的高表達可增強糖酵解，ErbB2高表達乳腺癌細胞對糖酵解抑制劑的敏感性增加[21]，而且ErbB2介導的糖酵解在乳腺癌細胞的遷移中起重要作用[22]。因此，我們擬研究糖酵解抑制劑2-DG對ErbB2高表達MCF7/ ErbB2細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為進一步研究2-DG與其它抑制劑的聯(lián)用在治療ErbB2高表達乳腺癌中的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 乳腺癌MCF7/ ErbB2細胞株由軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所施明教授惠贈。

1.1.2 實驗試劑 CellTiter 96 Aqueous ONE Solution Cell Proliferation Assay (MTS)試劑盒購于美國Promega公司； DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin, PS)、胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購于廣州蕊特生物科技有限公司；G418購于美國Amersco公司；蛋白分子標準和PVDF膜購于美國Bio-Rad公司；β-actin抗體和2-DG購于美國Sigma公司； HK II抗體購自美國Santa Cruz公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒以及辣根酶過氧化物酶標記的二抗購于上海碧云天生物技術有限公司；Matrigel 基底膠和細胞培養(yǎng)池購自美國BD公司；Western blotting化學發(fā)光試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司；葡萄糖檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌MCF7/ ErbB2細胞用含10% FBS、1% PS和300 μg/ml G418的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)，2～3d換液。

1.2.2 細胞增殖實驗 將對數(shù)生長期的細胞消化并計數(shù)后，按每孔5000個細胞加入96孔板中，待細胞貼壁后，更換含有不同濃度2-DG(0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32mM)的培養(yǎng)基，每個濃度設置3孔。2-DG處理48h后，用MTS試劑盒檢測細胞增殖。具體操作如下：每孔中加入20 μl MTS，微量振蕩器上振蕩1min，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3h，用酶標儀于波長490nm處測定每孔的吸光度值，并繪制細胞增殖抑制曲線。

1.2.3 細胞遷移實驗 實驗前撤血清饑餓細胞12h，用胰蛋白酶消化，用含0.2% BSA的DMEM/F12培養(yǎng)基制備細胞懸液并進行細胞計數(shù)，以每孔8×104個細胞和2-DG(0, 0.5, 1, 2 mM)鋪入8 μm細胞培養(yǎng)池上室，下室加入700 μl含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，取出小室，用 PBS清洗小室，用浸濕的棉簽擦去上室細胞，在下室加入700 μl 10%甲醇固定遷移細胞15min，吸走甲醇，加入700 μl 0.1% 結晶紫染色20min，洗去染液，倒置于載玻片上，于37℃烘干，將烘干后的小室放于倒置顯微鏡(×100)下隨機選取5個視野拍照和染色細胞計數(shù)。以遷移的細胞數(shù)表示細胞遷移能力，實驗重復3次。

1.2.4 細胞侵襲實驗 在小室的上室鋪入Matrigel (200～300μg/ml )100 μl 后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)包被2h，后續(xù)實驗步驟同細胞遷移實驗，以侵襲的細胞數(shù)表示細胞侵襲能力，實驗重復3次。

1.2.5 葡萄糖攝取量及乳酸生成量測定 將MCF7/ErbB2細胞接種于12孔板(2×105個細胞/孔)，于細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24h后，更換含有不同濃度2-DG(0, 0.5, 1, 2 mM)的DMEM低糖培養(yǎng)基，每種濃度設置3個孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用48h后，收集培養(yǎng)基，分別用葡萄糖檢測試劑盒和乳酸測定試劑盒檢測葡萄糖和乳酸濃度，根據(jù)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度或乳酸濃度計算細胞對葡萄糖的攝取量和乳酸生成量，以1×105個細胞對葡萄糖的攝取量(或乳酸生成量)來表示。實驗重復3次。

1.2.6 Western Blot 將MCF7/ErbB2細胞接種于6孔板(4×105細胞/孔)，于細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24h后，用1mM 2-DG處理細胞，分別于0、4、8、12、24h后收集細胞，加入100 μl細胞裂解液裂解，利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取35 μg變性后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，100～120V進行1.5h，濕轉(zhuǎn)電泳儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜，電流300 mA，120min。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，1×TBST洗膜3次，每次5min，4℃過夜孵育HK II一抗(1:100稀釋)，室溫孵育辣根酶過氧化物標記的二抗(1:1000稀釋)1h，以β-actin作為內(nèi)參，化學發(fā)光試劑盒檢測HKII 條帶，用Image Lab軟件拍照。實驗重復3次。

2 結果

2.1 2-DG對MCF7/ErbB2細胞增殖的影響 實驗結果顯示，2-DG(0.5～32mM)對乳腺癌MCF7/ErbB2細胞的增殖有明顯抑制作用，且2-DG濃度越大對細胞增殖的抑制作用越強，見圖1，說明2-DG對MCF7/ErbB2細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性。

圖1 2-DG抑制MCF7/ErbB2細胞的增殖Figure 1 2-DG inhibits the proliferation of MCF7/ErbB2 cells

2.2 2-DG對MCF7/ErbB2細胞遷移的影響 實驗結果顯示，不同濃度2-DG(0.5, 1, 2mM)均能減少遷移的MCF7/ErbB2細胞數(shù)，與2-DG未處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；而且隨著2-DG濃度的增加，MCF7/ErbB2細胞遷移的細胞數(shù)逐漸減少，即遷移細胞數(shù)的減少與2-DG濃度呈劑量依賴性，見圖2，說明2-DG不僅可以抑制MCF7/ErbB2細胞的增殖，同時也可以有效抑制其遷移能力。

圖2 2-DG 抑制MCF7/ErbB2細胞的遷移Figure 2 2-DG inhibits the migration of MCF7/ErbB2 cells 注：A. 2-DG(0, 0.5, 1, 2 mM)處理MCF7/ErbB2細胞48 h后，遷移細胞的染色圖； B. A圖的遷移細胞數(shù)

2.3 2-DG對MCF7/ErbB2細胞侵襲的影響 進一步研究2-DG是否對MCF7/ErbB2細胞的侵襲有抑制作用。實驗結果顯示，不同濃度2-DG(0.5， 1, 2mM)對侵襲的MCF7/ErbB2細胞數(shù)均有抑制作用，與2-DG未處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖3；而且侵襲細胞數(shù)的減少表現(xiàn)出對2-DG濃度的依賴性，即隨著2-DG濃度的增加，侵襲的細胞數(shù)逐漸減少，說明2-DG可降低MCF7/ErbB2細胞的侵襲能力。

2.4 2-DG對MCF7/ErbB2細胞糖酵解的影響 研究2-DG抑制增殖、遷移和侵襲的分子機制發(fā)現(xiàn)， 不同濃度的2-DG(0.5, 1, 2mM)均減少了MCF7/ErbB2細胞對葡萄糖的攝取量和乳酸生成量，與2-DG未處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖4。而且葡萄糖攝取量和乳酸生成量的減少呈現(xiàn)出對2-DG濃度的依賴性，即隨著2-DG濃度的增加，葡萄糖攝取量和乳酸生成量逐步降低。葡萄糖攝取量和乳酸生成量是反映糖酵解的兩個指標，說明2-DG能抑制MCF7/ErbB2細胞的糖酵解。

圖3 2-DG抑制MCF7/ErbB2細胞的侵襲Figure 3 2-DG inhibits the invasion of MCF7/ErbB2 cells注：A. 2-DG(0, 0.5, 1, 2mM)處理MCF7/ErbB2細胞48 h后，侵襲細胞的染色圖； B. A圖的侵襲細胞數(shù)

圖4 2-DG抑制MCF7/ErbB2細胞的糖酵解Figure 4 2-DG inhibits the glycolysis of MCF7/ErbB2 cells

注：A. 2-DG(0, 0.5, 1, 2mM)對MCF7/ErbB2 細胞葡萄糖攝取量的影響；B. 2-DG(0, 0.5, 1, 2mM)對MCF7/ErbB2 細胞乳酸生成量的影響

2.5 2-DG對MCF7/ErbB2細胞HKII的影響 用1mM 2-DG處理MCF7/ErbB2細胞，不同時點(4、8、12、24h)后用Western blot檢測HKII蛋白水平，實驗結果顯示，與0h組比較，4～8h后HKII蛋白水平顯著降低，且在12h達最低值，24h后恢復至4～8h水平，見圖5，說明1 mM 2-DG可降低HKII蛋白水平，且抑制效果與作用時間有關。

圖5 2-DG降低MCF7/ErbB2細胞HKII蛋白水平Figure 5 2-DG decreases HKII protein levels in MCF7/ErbB2 cells

3 討論

與正常細胞相比，大多數(shù)惡性腫瘤細胞具有更高的無氧酵解水平，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細胞仍優(yōu)先通過無氧糖酵解滿足其對能量以及生物大分子的需求，這種現(xiàn)象被稱為瓦伯格效應[23]。當抑制腫瘤細胞糖酵解后，腫瘤細胞無法通過糖酵解途徑產(chǎn)生其不斷增殖所需的ATP和生物大分子，進而可有效減緩腫瘤進程[24]。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose, 2-DG)抑制癌細胞增殖的機制主要有兩種，一種是通過抑制糖酵解水平，從而減少ATP生成量，最終抑制細胞的增殖[13, 15]；另一種是通過阻斷細胞周期從而抑制細胞的增殖，如2-DG使非霍奇金淋巴瘤細胞停滯于G0/G1期[13]，使胰腺癌細胞阻滯于G2 /M及S期[16]。本實驗結果顯示，在ErbB2高表達的乳腺癌細胞MCF7/ ErbB2中， 2-DG可顯著抑制其增殖能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，2-DG顯著降低了MCF7/ ErbB2細胞的葡萄糖攝取量及乳酸生成量，說明2-DG通過降低糖酵解水平從而抑制MCF7/ ErbB2細胞的增殖，與上述第一種機制一致。目前2-DG抑制卵巢癌、頭頸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、間皮瘤、肝癌和結腸癌細胞的增殖已被證實[17]。但也有文獻報道，2-DG對乳腺癌細胞(4T1和MDA-MB-231)以及骨肉瘤細胞(DLM8-luc-M1)的增殖無抑制作用，其可能原因是與癌細胞的種類和種屬有關。

2-DG不僅能抑制癌細胞的增殖，還可以影響癌細胞的遷移和侵襲能力。Park 等報道，在耐奧沙利鉑的結直腸癌細胞中2-DG通過降低去整合素-金屬蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase, ADMA10)和ADMA17的表達從而抑制上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchy- mal transition, EMT)，最終抑制細胞的遷移[25]。Sottnik等[18]發(fā)現(xiàn)，2-DG可減少 組織蛋白酶L的生成，進一步影響細胞骨架蛋白，重塑細胞骨架使癌細胞偽足延伸障礙，最終降低骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力。我們的研究結果表明，2-DG能抑制MCF7/ErbB2細胞的遷移和侵襲。因為糖酵解的終產(chǎn)物乳酸在癌細胞的遷移侵襲中起重要作用[26,28]，我們推測，2-DG顯著降低乳酸生成量是其抑制細胞遷移侵襲的分子機制。

本實驗結果顯示，2-DG能顯著下調(diào)MCF7/ ErbB2細胞的HKII蛋白水平，是2-DG抑制糖酵解的分子機制，與劉銅軍等[15]報道一致。Hong 等[29]發(fā)現(xiàn)，2-DG通過增加O-連接糖基化從而上調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達，TXNIP是細胞葡萄糖攝取的負調(diào)控因子，因此2-DG通過抑制細胞對葡萄糖的攝取從而抑制糖酵解。在MCF7/ErbB2細胞中2-DG是否能增加O-連接糖基化，需要進一步實驗研究證實。

當然本實驗還存在不足，如只有一種ErbB2高表達的乳腺癌細胞和缺乏體內(nèi)實驗。 為了進一步證實2-DG對ErbB2高表達細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，我們還將研究2-DG 對SK-BR-3和BT474細胞的體外抑制作用，并建立小鼠模型以研究2-DG對ErbB2高表達乳腺癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)抑制作用。

4 結論

本研究證實，2-DG通過下調(diào)HKII的蛋白水平從而降低了糖酵解，最終抑制了MCF7/ ErbB2細胞的增殖、遷移和侵襲，為進一步研究2-DG與其它抑制劑的聯(lián)用在治療ErbB2高表達乳腺癌中的作用奠定了實驗基礎。