鐘穎 牛婷 代洪波

摘要：為獲得穩(wěn)定表達(dá)重組豬α6干擾素的畢赤酵母。人工合成PoIFN-α6基因片段，連接至pPICZαA質(zhì)粒，構(gòu)建PoIFN-α6畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-PoIFNα6；經(jīng)SacI酶線性化后轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克?。粌?yōu)化畢赤酵母表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了體外抗病毒活性測(cè)定。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表達(dá)重組豬α6干擾素的畢赤酵母，以1%甲醇誘導(dǎo)72 h后，菌體上清SDS-PAGE可見(jiàn)20 kDa左右目的條帶，Western blot檢測(cè)為陽(yáng)性；表達(dá)的重組豬干擾素α活性在PRRSV/Marc-145、VSV/MDBK、PRV/Vero、PEDV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15和TGEV/PK-15系統(tǒng)中均具有良好的抗病毒活性。說(shuō)明PoIFN-α6在細(xì)胞上清中表達(dá)成功，并且在不同宿主細(xì)胞中均有抗病毒活性。

關(guān)鍵詞：干擾素，重組豬干擾素α6，畢赤酵母，抗病毒活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2018）08-0005-03

近幾年，豬瘟、豬偽狂犬病、豬流行性腹瀉、豬繁殖與呼吸綜合征等病毒性傳染病在各大小型養(yǎng)殖場(chǎng)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。而針對(duì)病毒性疫病尚無(wú)特效藥物進(jìn)行治療。研究表明干擾素（IFN）是一類(lèi)由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能的糖蛋白[3-5]。干擾素I型（尤其是IFN-α、IFN-β）因其生物活性，成為了目前研究最廣的細(xì)胞因子之一[6，7]，到目前為止，尚未有重組豬干擾素α（Porcine interferon-α，PoIFN-α）類(lèi)生物制劑上市。PoIFN-α包含17個(gè)家族蛋白，不同蛋白間氨基酸高度同源，均有良好的抗病毒活性[8]。PoIFN-α對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、水皰性口炎病毒、流行性腹瀉病毒等引起的疫病有良好的預(yù)防與治療效果[9-13]。此外，PoIFN-α還有免疫調(diào)節(jié)作用，Razzuoli等[14，15]發(fā)現(xiàn)，口服低劑量的PoIFN-α可以有效預(yù)防仔豬斷奶期應(yīng)激，增強(qiáng)仔豬的免疫抵抗力。

分泌型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA，內(nèi)含高效的啟動(dòng)子醇氧化酶（AOX1）、多克隆位點(diǎn)、分泌信號(hào)肽α、線性化酶切位點(diǎn)、抗性篩選標(biāo)記和組氨酸標(biāo)簽等，是高效分泌表達(dá)、檢測(cè)、純化外源蛋白的常用載體[16]。與原核表達(dá)外源蛋白相比，酵母表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、表達(dá)蛋白具有天然構(gòu)象（糖基化、蛋白加工等），具有更高的生物活性、易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)、蛋白表達(dá)量高、成本低、易純化等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

本試驗(yàn)將PoIFN-α6基因連接到pPICZαA載體，構(gòu)建pPICZαA-PoIFNα6表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得高效表達(dá)PoIFNα6的畢赤酵母；對(duì)畢赤酵母表達(dá)的PoIFNα6進(jìn)行體外抗病毒活性研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、載體與菌株

牛腎細(xì)胞（MDBK）、猴腎細(xì)胞（Marc-145）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、豬腎細(xì)胞（PK-15）、水皰性口炎病毒（VSV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)二型病毒（PCV2）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、表達(dá)載體pPICZaA均由四川華神獸用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa。

1.2 主要試劑

DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量試劑盒購(gòu)自AXYGEN；DNA Marker、T4連接酶、小鼠抗His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、DNA Marker、Protein Marker、蛋白胨、酵母氮源培養(yǎng)基、葡萄糖、YNB、W-TMB顯色試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Xho I、XbaI和SacI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB（北京）；ZecionTM購(gòu)自Thermo Fisher scientific。

1.3 PoIFN-α6表達(dá)載體的構(gòu)建

參照GeneBank中的IFNα6（GenBank：GQ415060），5和3端分別加X(jué)ho I和Xba I酶切位點(diǎn)，酵母密碼子偏嗜性由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成后將其克隆至pPICZaA載體中，將獲得載體命名為pPICZαA-PoIFNα6。

1.4 PoIFNα6的表達(dá)與鑒定

將重組載體pPICZαA-PoIFNα6經(jīng)SacI限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)化至X33感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含ZecionTM（200 μg/mL）抗性YPD平板篩選陽(yáng)性菌落并挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)72 h后收集細(xì)胞上清進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的X33細(xì)胞上清為陰性對(duì)照。

SDS-PAGE結(jié)束后，利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，PBST洗膜4次，每次5 min；將PVDF膜與小鼠抗HIS單克隆抗體（1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜4次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；進(jìn)行W-TMB顯色。

1.5 PoIFNα6活性測(cè)定

參照細(xì)胞病變抑制法[17]并根據(jù)不同細(xì)胞系/對(duì)應(yīng)病毒（PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK-15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK）進(jìn)行體外活性檢測(cè)。細(xì)胞上清按10倍稀釋?zhuān)B續(xù)稀釋7個(gè)梯度，每個(gè)梯度可設(shè)4個(gè)重復(fù)。中和的病毒含量為300～500 TCID50，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)90%以上細(xì)胞病變時(shí)結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀讀取570 nm波長(zhǎng)數(shù)值，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算細(xì)胞上清的抗病毒活性效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體pPICZαA-PoIFN-α6的鑒定

將優(yōu)化后的PoIFN-α與pPICZαA經(jīng)雙酶切后連接轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，ZecionTM（25 μg/mL）篩選平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行PoIFN-α6菌落PCR鑒定（目標(biāo)條帶為1 035 bp）。經(jīng)1%凝膠電泳分析，與預(yù)期一樣。測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄基因序列一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 PoIFNα6的表達(dá)與鑒定

將載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33后，使用ZecionTM篩選平板挑取單個(gè)菌落，經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo)72 h后，離心取菌體上清經(jīng)SDS-PAGE分析，在20～25 kDa處有特異目的蛋白條帶（圖2），大小與預(yù)期相符；而且Western blot檢測(cè)表明該蛋白能通過(guò)his標(biāo)簽檢測(cè)（圖3），表明PoIFNα蛋白在細(xì)胞上清成功表達(dá)。

2.3 PoIFNα6活性研究

分別在PRRSV/Marc-145、PEDV/Vero、PRV/Vero、PPV/PK-15、PCV2/PK15、TGEV/PK-15、VSV/MDBK系統(tǒng)上進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)，結(jié)果如表1所。由表1可知，干擾素在多種來(lái)源的動(dòng)物細(xì)胞中均表現(xiàn)出良好的抗病毒活性，在不同來(lái)源細(xì)胞中的抗病毒活性有差異，但其比活力均大于106 U/mg。

3 討論

當(dāng)今豬病形式復(fù)雜，病毒性疾病占主導(dǎo)地位[18]，特別是近幾年暴發(fā)的豬流行性腹瀉、豬偽狂犬病給養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)了直接的經(jīng)濟(jì)損失。干擾素生物制劑由于其自身優(yōu)勢(shì)成為了研究熱點(diǎn)。1986年，Lefevre[19，20]等首次利用大腸桿菌表達(dá)PoIFN-α。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者也相繼開(kāi)展了PoIFN-α的研究，實(shí)現(xiàn)了PoIFN-α原核表達(dá)。由于大腸桿菌表達(dá)的PoIFN-α多以包涵體形式存在，表達(dá)產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性等工藝處理后才有生物活性，但處理后的PoIFN-α活性損失較大、工藝復(fù)雜導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)[21-23]。與原核表達(dá)外源蛋白相比，酵母表達(dá)外源蛋白具有天然構(gòu)象不需要經(jīng)過(guò)變形、復(fù)性等處理就具有較好的生物活性；在生產(chǎn)實(shí)踐中酵母具有高密度發(fā)酵培養(yǎng)、外源蛋白表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)成功獲得穩(wěn)定表達(dá)PoIFN-α6的畢赤酵母，并使用多種體外系統(tǒng)進(jìn)行了活性測(cè)定。其中VSV/MDBK系統(tǒng)是豬干擾素抗病毒活性檢測(cè)系統(tǒng)中使用最廣泛的活性測(cè)定方法，在該系統(tǒng)中本研究所表達(dá)的重組豬干擾素活性（2.79×107 U/mg）比國(guó)內(nèi)報(bào)道如：姚清俠[24]（8.0×106 U/mg）、葛麗[25]（4.0×104 U/mg）等略高。此外在多個(gè)系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，豬重組干擾素α6在猴源細(xì)胞Marc-145、Vero和豬源細(xì)胞PK-15以及牛源細(xì)胞MDBK中均表現(xiàn)出良好的抗病毒活性，且對(duì)不同種類(lèi)病毒也具有較高的抗病毒活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明豬重組干擾素α6具有廣譜抗病毒活性，這種廣譜性表現(xiàn)為對(duì)多種宿主的多種病毒的廣譜抗病毒活性，沒(méi)有種屬特異性。

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