金 麗, 劉芳同, 李 偉, 張建坡

(吉林化工學(xué)院, 化學(xué)與制藥工程學(xué)院, 吉林 吉林 132022)

近年來, 對(duì)多模態(tài)融合技術(shù)的研究已成為生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]. 具有磁性/熒光雙模態(tài)成像功能的復(fù)合材料可提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度, 在細(xì)胞標(biāo)記和分離、 藥物靶向輸送及核磁共振等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-5]. 磁性中心材料多為具有超順磁性的納米材料, 如Fe3O4[6]、 Fe2O3[7]和含釓化合物等. 由于磁性材料(Fe3O4)易團(tuán)聚、 抗腐蝕性差、 難洗滌且易導(dǎo)致發(fā)光粒子的熒光猝滅[8]及熒光強(qiáng)度降低, 因此其應(yīng)用受到限制. Gd3+的4f層有7個(gè)未成對(duì)電子, 具有較強(qiáng)的順磁性, 不會(huì)引起發(fā)光粒子熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯猝滅, 因而含釓化合物(如氧化釓[9-10]、 氟化釓[11-12]、 磷酸釓[13-15]、 釩酸釓[16-17]、 碳酸釓[18]等)廣泛應(yīng)用于磁共振成像(MRI)領(lǐng)域.

CdTe量子點(diǎn)具有光學(xué)穩(wěn)定性良好、 熒光信號(hào)強(qiáng)、 激發(fā)光譜寬、 熒光發(fā)射光譜窄， 且對(duì)稱、 熒光壽命長(zhǎng)及熒光特性隨尺寸可控[19-21]等優(yōu)點(diǎn), 廣泛應(yīng)用于體內(nèi)和體外熒光成像, 但半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有毒性且穩(wěn)定性較差. SiO2是一種具有高光學(xué)透明性的材料, 具有良好的生物相容性表面, 可用于量子點(diǎn)的表面修飾. 文獻(xiàn)[22]采用微乳液法制備單分散的SiO2修飾CdTe量子點(diǎn), 可明顯改善量子點(diǎn)的穩(wěn)定性和生物相容性. 微乳液法需使用大量的有機(jī)溶劑, 成本較高且不利于環(huán)境保護(hù), 基于此, 本文用水和乙醇的混合溶液, 通過正硅酸乙酯水解, 合成單分散的SiO2修飾CdTe量子點(diǎn)微球， 并將GdCl3和NH4F與SiO2修飾CdTe量子點(diǎn)混合后, 通過具有活性的Si—OH基與Gd離子相互作用, 將Gd以GdF3的形式偶聯(lián)在SiO2表面, 得到核殼結(jié)構(gòu)的CdTe@SiO2@GdF3微球. 采用透射電鏡(TEM)、 能量散射X射線光譜(EDXA)、 核磁共振成像(MRI)、 Fourier變換紅外光譜(FT-IR)及熒光光譜等方法對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行表征.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

巰基丙酸(MPA, 美國酷爾化學(xué)科技有限公司); 碲粉(美國Sigma-Aldrich公司)； 氯化釓、 氟化氨、 氯化鎘、 硼氫化鈉(分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水.

用Tecnai G220型透射電鏡(美國FEI公司)觀察產(chǎn)物的形貌和尺寸； 用JSM-6490型能量散射X射線光譜儀(日本電子公司)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行EDXA分析； 用F-280型熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)測(cè)得熒光光譜； 用Shimadzu UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)測(cè)得紫外吸收光譜； 用Nikon D7000型照像機(jī)(日本尼康公司)得到合成材料在自然光和紫外光照射下的發(fā)光照片； 用3TS Magnetom Trio型核磁共振儀(德國SIEMENS公司)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行磁共振成像表征, 得到T1-映射序列(TR為200 ms, TE為13 ms, 樣品厚度為1.5 mm)； 用MODEL550型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)測(cè)定產(chǎn)物的吸光度.

1.2 CdTe量子點(diǎn)的制備

參考文獻(xiàn)[23], 將7 mg碲粉與適量硼氫化鈉加入3 mL雙蒸水中, 磁力攪拌至溶液呈淺粉色, 得到溶液A； 將48 mg氯化鎘溶解于100 mL水中, 通氮?dú)獬?0 min后加入80 μL巰基丙酸, 用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=10, 得到溶液B. 將溶液A加入溶液B中, 于100 ℃加熱回流1 h, 得到CdTe量子點(diǎn), 冷卻后于1～4 ℃貯存?zhèn)溆? 通過與羅丹明6G(以無水乙醇為溶劑, 其量子產(chǎn)率按95%記)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比, 求得CdTe量子點(diǎn)的熒光量子效率為25%[24].

1.3 CdTe@SiO2微球的制備

將35 mL無水乙醇和5 mL硅酸四乙酯(TEOS)混合, 攪拌20 min, 加入7 mL CdTe量子點(diǎn), 50 ℃油浴加熱30 min, 將反應(yīng)后的溶膠離心(6 000 r/min, 3 min), 用V(去離子水)∶V(乙醇)=1的混合溶液洗滌3次(重復(fù)超聲溶解和離心操作), 將所得固體粉末于80 ℃烘干備用.

1.4 CdTe@SiO2@GdF3微球的制備

稱取0.015 8 g的氯化釓溶于3 mL去離子水中, 另稱取0.007 4 g NH4F溶于10 mL去離子水中, 備用. 將CdTe@SiO2微球通過超聲溶解于配制的3 mL氯化釓溶液中, 加入配制的NH4F溶液, 攪拌10 min, 75 ℃油浴加熱攪拌 2 h[25], 離心分離(6 000 r/min, 3 min), 用V(去離子水)∶V(乙醇)=1的混合溶液洗滌3次(重復(fù)超聲溶解和離心操作), 將所得固體粉末于80 ℃干燥, 得到灰綠色或橘紅色粉末, 即為CdTe@SiO2@GdF3微球.

2 結(jié)果與討論

2.1 形成過程分析

CdTe@SiO2@GdF3微球合成過程如圖1所示. 由圖1可見, CdTe量子點(diǎn)在合成過程中使用了過量的硼氫化鈉, 可使TEOS水解. 在乙醇/水體系中, 先將CdTe量子點(diǎn)包覆于均勻SiO2層中, 再將已包覆的CdTe@SiO2微球分散于一定量的GdCl3和NH4F混合溶液中, 基于CdTe@SiO2微球表面具有活性的Si—OH與Gd離子相互作用[25], 將Gd以GdF3的形式連接到CdTe@SiO2微球表面合成CdTe@SiO2@GdF3微球.

圖1 CdTe@SiO2@GdF3微球合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of CdTe@SiO2@GdF3 microsphere synthesis

2.2 TEM分析

用TEM對(duì)合成材料的形貌進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖2所示. 由圖2(A)可見, CdTe的粒徑為3～5 nm； 由圖2(B)可見, CdTe@SiO2微球分散均勻， 粒徑均一度較好, 微球的尺寸約為220 nm, SiO2層厚度約為59 nm; 由圖2(C)可見, CdTe核外部包覆一定厚度的SiO2層, 且包覆完全均勻、 表面光滑, 為球形核殼結(jié)構(gòu)； 由圖2(D)可見, CdTe量子點(diǎn)中心核與SiO2層以及外殼層的GdF3之間存在明顯襯度對(duì)比, 大量的GdF3以小顆粒形態(tài)分散于SiO2表層, 顆粒尺寸為5～8 nm, GdF3層包覆均勻. 產(chǎn)物的粒徑略減小, 但仍具有良好的分散性, 無團(tuán)聚現(xiàn)象, CdTe@SiO2@GdF3微球仍為核殼結(jié)構(gòu).

圖2 CdTe量子點(diǎn)(A)、 CdTe@SiO2微球(B)、 放大CdTe@SiO2微球(C)和CdTe@SiO2@GdF3微球(D)的TEM照片F(xiàn)ig.2 TEM images of CdTe quantum dots (A), CdTe@SiO2 microsphere (B)， CdTe@SiO2microsphere (enlarged drawing) (C) and CdTe@SiO2@GdF3 microsphere (D)

圖3 SiO2微球(a)、 CdTe@SiO2微球(b)和 CdTe@SiO2@GdF3微球(c)的EDXA結(jié)果 Fig.3 EDXA results of SiO2 microsphere (a), CdTe@SiO2 micros phere (b) and CdTe@SiO2@GdF3 microsphere (c)

2.3 EDXA分析

用EDXA分析合成材料的組成元素, 結(jié)果如圖3所示. 由圖3可見： 在CdTe@SiO2微球表面檢測(cè)到Si,O元素(與純SiO2微球結(jié)果一致)和微量的Na元素, 未檢測(cè)到Cd和Te元素, 表明CdTe量子點(diǎn)完全被SiO2包被； 在CdTe@SiO2@GdF3微球表面檢測(cè)到Si,O,F和Gd元素, 表明GdF3已修飾在CdTe@SiO2微球表面. 圖4為在CdTe@SiO2@GdF3微球表面的EDXA成像. 由圖4可見, 在CdTe@SiO2@GdF3微球表面存在O元素(圖4(B)中青色點(diǎn))、 Si元素(圖4(C)中藍(lán)色點(diǎn))和Gd元素(圖4(D)中紅色點(diǎn)), 即Gd元素位于CdTe@SiO2@GdF3微球表面.

圖4 CdTe@SiO2@GdF3微球表面的EDXA成像Fig.4 EDXA imagings on surface of CdTe@SiO2@GdF3 microsphere

2.4 FT-IR分析

圖5 CdTe@SiO2微球(a)和CdTe@SiO2@GdF3微球(b)的FT-IR譜Fig.5 FT-IR spectra of CdTe@SiO2 microsphere (a) and CdTe@SiO2@GdF3 microsphere (b)

用FT-IR譜對(duì)CdTe@SiO2微球和CdTe@SiO2@GdF3微球的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征, 結(jié)果如圖5所示. 由圖5中曲線a可見: 在3 432,1 632 cm-1附近出現(xiàn)OH和H2O的振動(dòng)峰; 1 404 cm-1處的吸收峰可能是因?yàn)楸砻嫖搅薈O2所致； 1 085,802 cm-1附近為Si—O—Si的反對(duì)稱與對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰； 947 cm-1附近為Si—OH的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰, 表明CdTe@SiO2微球的表面為SiO2層, 且其表面存在大量的—OH和H2O, 從而有助于氟化釓包覆. 由圖5中曲線b可見： 在3 437 cm-1處的吸收峰為Si—OH中的—OH振動(dòng)峰； 3 153,1 632 cm-1處的吸收峰也是—OH的伸縮振動(dòng)峰, 由于樣品吸收水分所致； 1 398 cm-1處的振動(dòng)吸收峰可能是表層吸附了CO2所致； 1 095 cm-1處為Si—O—Si的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰； 959 cm-1處為Si—OH的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰, 與曲線a相比, 這兩個(gè)峰均發(fā)生了位移和強(qiáng)度減弱, 表明GdF3已包覆在SiO2表層； 802 cm-1附近為Si—O—Si的反對(duì)稱與對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰, 與曲線a相比, 吸收峰波數(shù)未發(fā)生明顯變化, 但強(qiáng)度減弱. 此外, 在CdTe@SiO2@GdF3表面仍存在大量的—OH基團(tuán), 具有SiO2的表面性質(zhì), 仍可與離子發(fā)生鍵合作用. 氟化物在中紅外區(qū)沒有吸收峰, 因而在曲線b中未出現(xiàn)新的吸收峰.

2.5 熒光光譜分析

用熒光發(fā)射光譜考察CdTe量子點(diǎn)修飾SiO2和摻釓后熒光性能的變化， 結(jié)果如圖6所示. 由圖6(A)可見, 與CdTe量子點(diǎn)相比, CdTe@SiO2微球的熒光發(fā)射強(qiáng)度降低, 熒光發(fā)射波長(zhǎng)從526 nm紅移至529 nm, 可能是SiO2包覆后CdTe量子點(diǎn)發(fā)生團(tuán)聚, 從而引起熒光發(fā)射光譜紅移. 相對(duì)于CdTe@SiO2微球, CdTe@SiO2摻釓后的熒光發(fā)射強(qiáng)度進(jìn)一步降低, 且熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移至536 nm, 可能是由于粒子周圍的局域折射率逐漸增強(qiáng), 導(dǎo)致熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移. 圖7為合成的CdTe@SiO2@GdF3微球在自然光和紫外光(365 nm)照射下的照片. 由圖7可見, CdTe@SiO2@GdF3微球具有良好的熒光發(fā)射性能, 且熒光發(fā)射波長(zhǎng)可通過選取不同波長(zhǎng)的量子點(diǎn)調(diào)控.

圖6 挑選的CdTe量子點(diǎn)、 CdTe@SiO2微球和CdTe@SiO2@GdF3微球的熒光發(fā)射光譜(A)及歸一化的熒光光譜(B)Fig.6 Fluorescence emission spectra of selected CdTe quantum dots, CdTe@SiO2 microsphere and CdTe@SiO2@GdF3 microsphere (A) and norm alized fluorescence spectra (B)

圖7 3種CdTe@SiO2@GdF3微球在自然光和紫外光(365 nm)照射下的照片F(xiàn)ig.7 Photographs of three CdTe@SiO2@GdF3 microspheres irradiated by natural light and UV light (365 nm)

2.6 MRI分析

采用3T MRI掃描獲得T1-加權(quán)和弛豫成像圖, 對(duì)合成材料的磁共振成像性能進(jìn)行分析, 如圖8所示. 圖9為不同濃度CdTe@SiO2@GdF3微球的T1-加權(quán)和偽彩MR成像.

圖8 室溫下CdTe@SiO2@GdF3微球的弛豫率R1(1/T1)Fig.8 Relaxation rate R1 (1/T1) of CdTe@SiO2@GdF3microsphere at room temperature

a～f: c(Gd3+)=0,0.012,0.015,0.018,0.03,0.06 mol/L.圖9 不同濃度CdTe@SiO2@GdF3微球的 T1-加權(quán)和偽彩MR成像 Fig.9 T1-Weighted and pseudo color MR imaging of CdTe@SiO2 @GdF3 microsphere with different concentrations

由圖8可見: 隨著CdTe@SiO2@GdF3微球中Gd3+濃度的增加, T1-加權(quán)MRI信號(hào)強(qiáng)度逐漸增大; 不同濃度CdTe@SiO2@GdF3微球中Gd3+的弛豫速率(R1)的線性關(guān)系良好(R2=0.998). 由直線的斜率可得弛豫參數(shù)r1=3.48 s-1/(mmol·L-1), 表明合成的CdTe@SiO2@GdF3微球可用于T1-加權(quán)磁共振成像.

2.7 細(xì)胞毒性

用Mosmann的MTT(四唑鹽)比色法量化細(xì)胞毒性. 將不同質(zhì)量濃度的納米離子與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)共孵24 h, 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值, 結(jié)果列于表1. 由MTT法可知, 吸光度值與活細(xì)胞數(shù)成正比, 即吸光度越大, 活細(xì)胞數(shù)目越多. 由表1可見, 在5～200 μg/mL內(nèi), 不同質(zhì)量濃度CdTe@SiO2@GdF3微球溶液對(duì)吸光度的影響均較小, 當(dāng)CdTe@SiO2@GdF3微球溶液質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí), 細(xì)胞活力仍大于90%, 表明其對(duì)細(xì)胞的毒性作用較弱.

表1 CdTe@SiO2@GdF3微球?qū)CV304細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率的影響Table 1 Effect of CdTe@SiO2@GdF3 microsphere on proliferation rate of ECV304 cell

綜上所述, 本文在水/乙醇體系中制備了單分散的CdTe@SiO2微球, 該方法減少了有機(jī)溶劑的使用, 且操作簡(jiǎn)單、 條件溫和、 綠色環(huán)保. 通過NH4F將Gd修飾在CdTe@SiO2微球表面后, 得到了核殼結(jié)構(gòu)的CdTe@SiO2@GdF3微球. 相對(duì)于CdTe量子點(diǎn), CdTe@SiO2@GdF3微球的熒光發(fā)射光譜發(fā)生了紅移, 且熒光發(fā)射強(qiáng)度降低, 但CdTe@SiO2@GdF3微球仍具有良好的熒光發(fā)射性能. MRI分析表明, 弛豫參數(shù)r1=3.48 s-1/(mmol·L-1), 表明合成的CdTe@SiO2@GdF3微球具有良好的磁共振成像性能. 量化的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明, 當(dāng)CdTe@SiO2@GdF3微球溶液質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí), 細(xì)胞活力仍大于90%, 表明其對(duì)細(xì)胞的毒性作用較弱.

感謝吉林醫(yī)藥學(xué)院齊玲教授在Mosmann的MTT比色法量化細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的幫助.