李婷婷, 張桂蘭, 王之瑩, 陳愛亮

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 北京 100081

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，我國居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大的變化，火鍋、羊肉串等備受喜愛。然而，目前羊肉制品摻假現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重[1,2]，常見的摻假肉類主要包括豬肉、雞肉、鴨肉等，有的甚至還會(huì)摻入鼠肉[3,4]。這種欺詐行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)對社會(huì)發(fā)展帶來了消極影響。

目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種肉品摻假檢測技術(shù)[5]，主要包括以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附[6,7]、色譜質(zhì)譜技術(shù)[8～11]，以代謝物為基礎(chǔ)的紅外光譜技術(shù)[12]和以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測技術(shù)[13～17]等。其中，應(yīng)用最多的為基于熒光定量PCR的檢測技術(shù)，但是現(xiàn)有技術(shù)所需時(shí)間較長，無法滿足現(xiàn)場快速鑒別的要求。同時(shí)，以羊肉串摻假為例，其摻假的肉類品種可能有豬肉、雞肉、鴨肉、甚至老鼠肉等，如果逐個(gè)對可能的摻假物種進(jìn)行PCR檢測，則存在操作繁瑣、分析時(shí)間長等問題。

近年來，芯片式快速熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展為羊肉摻假鑒別等核酸檢測提供了一種快速、多重的熒光定量PCR檢測方法，其是一種將芯片技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的高新生物技術(shù)[18～20]。傳統(tǒng)的微芯片技術(shù)是運(yùn)用微電機(jī)系統(tǒng)(micro-electro-mechanical system，MEMS)技術(shù)，通過制作微管道等空間結(jié)構(gòu)及微加熱等控制結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)芯片上的快速PCR擴(kuò)增[21]，而本研究通過將引物、反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到芯片上，只需將模板滴加至微孔內(nèi)即可進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)現(xiàn)通過熒光信號檢測PCR產(chǎn)物。該技術(shù)也可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)(植物病原菌檢測、轉(zhuǎn)基因鑒別)、畜牧(牛類病害鑒別、魚類和家禽病原菌檢測)、食品安全(病原菌鑒別、微生物腐敗鑒別)、生命科學(xué)和醫(yī)療(人類疾病鑒別、人類基因檢測)等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉均購自北京市農(nóng)貿(mào)市場，鼠肉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供。

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、海藻糖等均購自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LUMEX分析儀器公司)；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；5424離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；MS 3渦旋儀(德國IKA公司)；KAPA SYBR?FAST Universal Kits(北京百諾威生物科技有限公司)；TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 樣品制備

用電子天平稱取羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉各20 mg，用于提取引物特異性實(shí)驗(yàn)所用模板。再按照不同重量百分比(表1)分別稱取不同肌肉組織進(jìn)行混合，作為模擬摻假樣品(每份樣品為20 mg)，總摻假比例為0～80%。

表1 研究所用模擬摻假樣品Table 1 Simulated samples used in this study.

注：“-”表示該樣品不含此成分。

1.4 DNA的提取及檢測

按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取制備好的樣品的基因組DNA。采用超微量分光光度計(jì)對提取的DNA進(jìn)行濃度及純度檢測。其濃度為10～20 ng/μL，且純度較高(A260/A280為1.8～1.9，A260/A230>2.0)，因此可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.5 引物特異性實(shí)驗(yàn)

研究所用引物均由北京生工生物技術(shù)有限公司合成，具體序列見表2。為了確定引物特異性，在ABI7500儀器上分別用羊源、豬源、雞源、鴨源與鼠源成分的特異性引物對5種肉的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L正、反向引物各0.4 μL，模板 2 μL，剩余用無菌去離子水補(bǔ)齊；反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 3 s，60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。添加熔解曲線。通過擴(kuò)增Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))來判斷引物的特異性，Ct<35為有效擴(kuò)增，Ct≥35為無效擴(kuò)增。

1.6 芯片式PCR

1.6.1芯片的制備 本研究的空芯片微陣列設(shè)計(jì)為5×6陣列，每個(gè)位點(diǎn)包含凍干固定的一對引物(表3)及反應(yīng)所需試劑。反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L正、反向引物各0.4 μL，剩余體積用無菌去離子水補(bǔ)齊，同時(shí)將5 μL 0.5 g/mL DMSO、1.65～1.95 mg保護(hù)劑BSA、0.6～1.2 mg賦型劑海藻糖與20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行混合。隨后取2 μL混合溶液滴加到芯片上，采用凍干機(jī)進(jìn)行凍干(-40℃，冷凍2 h)，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study.

表3 芯片中引物的位置(5×6)Table 3 The positions of primers in the chip (5×6).

1.6.2芯片式PCR反應(yīng) 將2 μL模擬摻假樣品1、2、3、4、5的基因組DNA分別滴加到芯片的第1、2、3、4、5列的反應(yīng)池內(nèi)，第6列為陰性對照，即不含任何模板。然后用640 μL礦物油將液體覆蓋，以免高溫蒸發(fā)，此方法無需繁瑣的配制體系與操作步驟，簡單快速。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 3 s，60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。添加熔解曲線。

1.7 ABI7500熒光定量PCR

在ABI7500儀器上分別用羊源、豬源、鴨源、雞源與鼠源性成分的特異性引物對5種模擬摻假樣品的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，10 mol/L 正、反向引物各0.4 μL，模板2 μL，剩余體積用水補(bǔ)齊即可。反應(yīng)程序與芯片式PCR相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性實(shí)驗(yàn)

引物的特異性是動(dòng)物源性成分核酸檢測技術(shù)的關(guān)鍵，本研究利用篩選出的羊源、豬源、鴨源、雞源與鼠源性成分的特異性引物對5種肉的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

以羊源性引物為例(圖1A)，用羊源性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除了羊源DNA出現(xiàn)擴(kuò)增且所對應(yīng)的熔解曲線均為單峰外，其他物種模板均無擴(kuò)增且熔解曲線為平滑的一條直線，說明羊源性引物的特異性較好。豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物與羊的結(jié)果一致，表明5對引物特異性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 引物特異性實(shí)驗(yàn)Fig.1 The specificity of primers.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源、鼠源性成分的特異性引物分別對5種肉的基因組DNA擴(kuò)增后的結(jié)果。

2.2 自制多重PCR芯片檢測模擬羊肉摻假樣品結(jié)果

本研究利用自制的羊肉摻假鑒別多重PCR芯片以及AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測，各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ct值見表4，擴(kuò)增曲線見圖2。

根據(jù)5種模擬摻假樣品的成分配比可知，每個(gè)樣品中均含有羊源性成分，因此，采用羊源性引物對5種模擬摻假樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，共5條擴(kuò)增曲線(圖2A)。同理，豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物的位置分別出現(xiàn)4條、3條、2條與1條擴(kuò)增曲線，結(jié)果與已知樣品中所含成分保持一致。由于在實(shí)際應(yīng)用中若摻假比例太低，則獲利微薄，因此，本研究將最低摻假比例設(shè)為20%，未對含量更低的樣品進(jìn)行檢測。從圖2可以看出，利用自制的PCR芯片對5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測，均可檢測到相應(yīng)的動(dòng)物源性成分，定性檢測準(zhǔn)確率為100%，同時(shí)，擴(kuò)增曲線表明自制的PCR芯片具有較好的擴(kuò)增效率，而且隨著動(dòng)物源性成分含量的降低，相應(yīng)的Ct值逐漸增大。

表4 模擬羊肉摻假樣品的擴(kuò)增Ct值(Lumex)Table 4 The Ct values of simulated adulterated mutton samples(Lumex).

2.3 ABI7500熒光定量PCR驗(yàn)證及結(jié)果比對

采用ABI7500儀器對5種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測，從而驗(yàn)證AriaDNA-10便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的性能。各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ct值見表5，擴(kuò)增曲線見圖3。

結(jié)合芯片式PCR和ABI7500熒光定量PCR的結(jié)果可知，本研究所建立的擴(kuò)增體系中，在AriaDNA-10儀器上用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增曲線不如ABI7500儀器顯示的曲線平滑，同時(shí)，從Ct值可以看出，采用ABI7500儀器進(jìn)行擴(kuò)增的Ct值均小于采用芯片進(jìn)行擴(kuò)增的Ct值，可能原因是芯片上的擴(kuò)增體系相對較少,導(dǎo)致達(dá)到閾值的時(shí)間偏后，因此，采用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)效率偏低。但是總體來說，2種PCR檢測方法的結(jié)果一致，2種方法均能準(zhǔn)確的檢測出5種成分，且隨著動(dòng)物源性成分含量的減少，相應(yīng)的Ct值會(huì)逐漸增加。需要注意的是，本研究無法通過Ct值進(jìn)行定量檢測，只能進(jìn)行定性檢測，即確定含有哪種成分的摻假。

圖2 Lumex儀器對不同樣品進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖Fig.2 The fluorescent amplification curves of the different samples by Lumex.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源和鼠源性成分的特異性引物對5種模擬摻假樣品擴(kuò)增后的結(jié)果。

表5 模擬羊肉摻假樣品擴(kuò)增Ct值(ABI7500)Table 5 The Ct values of simulated adulterated mutton samples(ABI7500).

圖3 ABI7500對不同樣品進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖Fig.3 The fluorescent amplification curves of the different samples by ABI7500.A～E依次為羊源、豬源、雞源、鴨源和鼠源性成分的特異性引物對5種模擬摻假樣品擴(kuò)增后的結(jié)果。

3 討論

本研究建立了基于芯片的快速熒光定量PCR檢測方法，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相比， PCR芯片一般由5×4或更多的反應(yīng)池組成，可實(shí)現(xiàn)樣品多指標(biāo)的檢測；由于芯片式PCR預(yù)先將反應(yīng)所需試劑和引物凍干保存，只需將提取的DNA模板滴加到芯片上即可進(jìn)行擴(kuò)增，簡化了檢測步驟、縮短了檢測時(shí)間。通過與ABI7500熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果具有一致性，均可準(zhǔn)確的檢測出5種成分，且Ct值均隨著動(dòng)物源性成分比例的減少而升高。

目前，已有很多關(guān)于利用PCR技術(shù)檢測肉制品中摻假成分的報(bào)道[27～29]。Prusakova等[30]采用多重PCR擴(kuò)增法，可同時(shí)鑒別肉類產(chǎn)品中5種常見的摻假肉類，每種肉類的檢測靈敏度可達(dá)30 pg。Dalsecco等[31]采用熒光定量PCR的方法，可以檢測10種不同的動(dòng)物源性成分；利用該方法對46種實(shí)驗(yàn)肉品混合物進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果顯示所有品種均鑒定正確，檢測靈敏度為1%；同時(shí)對14種商業(yè)的肉類產(chǎn)品進(jìn)行分析，結(jié)果表明14個(gè)樣品中有6個(gè)含有雞肉原料，由此可知，該方法對肉類產(chǎn)品的分析是有效和可靠的。普通PCR雖然操作簡單、成本較低，但是對產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測所需時(shí)間較長，而傳統(tǒng)的熒光定量PCR一般需要2 h才能完成，不適用于現(xiàn)場檢測。本研究所建立的芯片式熒光定量PCR擴(kuò)增法，由于所需樣本體積小(只需2 μL)，PCR升降溫反應(yīng)速度快，可縮短至30 min完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短。該芯片的研制及快速檢測方法的建立將有效的簡化羊肉制品摻假檢測的步驟、縮短檢測時(shí)間，同時(shí)所用芯片檢測儀器Lumex體積較小，攜帶方便，為現(xiàn)場檢測提供了技術(shù)支撐。

本研究雖然可以在30 min內(nèi)完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，但是要建立一種快速檢測體系，DNA提取也需快速進(jìn)行，目前雖然已經(jīng)有相關(guān)的快速提取DNA試劑盒，但大多數(shù)為磁珠法，需要進(jìn)行細(xì)胞裂解、去除蛋白質(zhì)等步驟，操作繁瑣，而PCR技術(shù)是一項(xiàng)非常靈敏的分子檢測技術(shù)，擴(kuò)增效率高，只需痕量DNA即可檢測。因此，本課題組開發(fā)了一種粗提DNA技術(shù)[32]，在5 min內(nèi)即可提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步縮短了檢測時(shí)間，為羊肉制品安全監(jiān)測、摻假監(jiān)管提供了理想的技術(shù)手段及方法。未來，如何將DNA提取、特異片段擴(kuò)增和數(shù)據(jù)收集整合為一體化的檢測方法仍需進(jìn)一步探索。