馬恒昌，常 璐，姚小強(qiáng)，姚雯還

（西北師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

0 引言

近年來(lái)熒光成像技術(shù)作為快速發(fā)展的醫(yī)學(xué)診療技術(shù)而受到廣泛的關(guān)注，而高質(zhì)量的細(xì)胞成像技術(shù)更需要具有生物相容性、亮度、穩(wěn)定性好的有機(jī)外源造影劑[1，2].2001年被發(fā)現(xiàn)并迅速發(fā)展的聚集誘導(dǎo)發(fā)光材料（AIEgens）是優(yōu)秀的候選材料，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝种品肿觾?nèi)運(yùn)動(dòng)效應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)的效果.一旦與生物分子結(jié)合或受到周?chē)锃h(huán)境影響，AIEgens就會(huì)被單獨(dú)點(diǎn)亮并且可以在高靈敏度熒光成像的基礎(chǔ)上獲取豐富的信息[3-7].近年來(lái)市面上有一些商品化的細(xì)胞核熒光染料，比如4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），它們只會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光[8-11]，這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷顯著的細(xì)胞自發(fā)熒光，更何況價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定[12].通過(guò)Suzuki反應(yīng)和季銨鹽反應(yīng)合成了含三苯胺吡啶基團(tuán)的超分子探針（TPPA-DBB）.通過(guò)熒光和紫外光譜的研究，以期其具備作為細(xì)胞成像熒光探針光學(xué)特質(zhì).同時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡和細(xì)胞毒性測(cè)試來(lái)研究該熒光超分子探針在活體細(xì)胞中的成像特征和生物相容性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三碘代三苯胺（分析純，安耐吉化學(xué)），4-吡啶硼酸（分析純，安耐吉化學(xué)），四三苯基磷鈀（分析純，阿拉丁試劑），1，4-二（溴甲基）苯（分析純，阿拉丁試劑），碳酸鉀，四氫呋喃，正己烷，石油醚等試劑均為分析純.

MERCURY核磁質(zhì)譜儀；Nicolet AVATAR 360 TF-IR紅外光譜儀；日本UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；美國(guó)PE公司LS-55熒光儀；日本OLYMPUS FV1200激光共聚焦顯微鏡；Zetasizer Nano ZS動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試儀.

1.2 合成

1.2.1 三苯胺三吡啶的合成

取三碘代三苯胺311.5 mg（0.5 mmol）溶于40 mL無(wú)水四氫呋喃中.取4-吡啶硼酸400.5 mg（2.25 mmol）溶于40 mL甲醇中并添加57.8 mg（0.05 mmol）四三苯基磷鈀和310 mg（2.25 mmol）碳酸鉀于三口瓶中攪拌0.5 h，完成后將三碘代三苯胺四氫呋喃溶液加入三口瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于120℃回流24 h.得到的產(chǎn)物三苯胺三吡啶（TPPA）為淡黃色固體.

1.2.2 超分子熒光探針的合成

將干燥的TPPA固體150 mg（0.31 mmol）溶于50 mL無(wú)水四氫呋喃中，在不斷攪拌下緩慢滴加對(duì)二芐溴36.75 mg（0.21 mmol）.滴加完成后，通氮?dú)獗Ｗo(hù)并在120℃條件下回流2 h.反應(yīng)完成后將反應(yīng)物用刮刀刮下并用甲醇重結(jié)晶并反復(fù)沖洗浸泡.最后得到的產(chǎn)物超分子熒光探針（TPPA-DBB）為橙紅色固體.TPPA-DBB的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 TPPA-DBB的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 表征與測(cè)試

1.3.1 紫外光譜測(cè)試

將配制好的不同濃度的溶液放入超聲波清洗儀中振蕩均勻0.5 h，并轉(zhuǎn)入2 cm光程的石英比色皿.待紫外光譜儀穩(wěn)定后通過(guò)波長(zhǎng)掃描模式測(cè)試最大吸收波長(zhǎng)和最大吸收強(qiáng)度.

1.3.2 熒光光譜測(cè)試

將配制好的不同濃度的溶液放入超聲波清洗儀中振蕩均勻0.5 h，并轉(zhuǎn)入2 cm光程的石英比色皿.待熒光光譜儀穩(wěn)定后通過(guò)波長(zhǎng)掃描模式確定熒光探針的激發(fā)波長(zhǎng)，并以此激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)試最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)及熒光發(fā)射強(qiáng)度.

1.3.3 DNA體外識(shí)別測(cè)試

配制1 g/L的TPPA-DBB溶液，然后分別稱(chēng)取0.06～8.00 mg系列不同質(zhì)量的DNA分子溶于TPPA-DBB水溶液中，之后將這些溶液放入超聲波清洗機(jī)中超聲10 min使其混合均勻，待冷卻至室溫后進(jìn)行熒光光譜的測(cè)定.

1.3.4 細(xì)胞毒性測(cè)試

選擇A549細(xì)胞為研究對(duì)象，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法檢測(cè)TPPA-DBB的細(xì)胞毒性.將對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞種于96孔培養(yǎng)板中（接種密度為1×104/孔），放入37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，然后將含有不同濃度的TPPA-DBB溶液分別依次滴加至不同孔中.TPPADBB 的濃度依次為 0，10，20，30，40，50μM，在 5%CO2、37℃的條件下孵育 24 h.向每個(gè)孔中加入 MTT 溶液10μL（5 g/L），再以相同條件繼續(xù)孵育2 h.最后在每個(gè)小孔中加入100μL二甲基亞砜并室溫靜置2 h.用熒光免疫分析儀檢測(cè)690 nm處各孔的吸光度，檢測(cè)熒光探針的細(xì)胞毒性.最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果由7組實(shí)驗(yàn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差得出.

1.3.5 細(xì)胞成像測(cè)試

將人肺癌細(xì)胞（A549）接種（接種密度為1×105/孔）在15 mm載玻片上貼壁生長(zhǎng)24 h，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，然后將濃度為20mg/L的TPPA-DBB用二甲基亞砜稀釋并滴加在載玻片中，并繼續(xù)孵育10min，繼而用PBS緩沖液洗滌.最后將制備好的細(xì)胞載玻片放置在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀(guān)察并記錄.

2 結(jié)果與討論

2.1 TPPA-DBB固體紫外和固體熒光測(cè)試

取TPPA-DBB的固體進(jìn)行紫外和熒光光譜測(cè)試，如圖2所示，固體最大紫外吸收峰為438 nm，固體熒光發(fā)射最大波長(zhǎng)為613 nm.計(jì)算TPPA-DBB共聚物的斯托克位移為175 nm.根據(jù)紫外和熒光光譜測(cè)試結(jié)果可以得出TPPA-DBB具有長(zhǎng)斯托克位移.通常具有長(zhǎng)斯托克位移的物質(zhì)具有背景干擾低、樣品穿透性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn).

2.2 TPPA-DBB在甲醇中的紫外光譜

選擇TPPA-DBB濃度范圍從1.0 mg/L到12.0 mg/L的甲醇溶液測(cè)試紫外可見(jiàn)吸收光譜.如圖3所示，圖中隨著TPPA-DBB質(zhì)量濃度逐漸增大，紫外吸光度也逐漸增大.從紫外光譜來(lái)看紫外吸收峰形沒(méi)有發(fā)生改變，而且最大吸收峰沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)移，說(shuō)明TPPA-DBB在甲醇溶液中沒(méi)有發(fā)生分子間相互作用.分析表明TPPA-DBB在甲醇溶液中具有很好的穩(wěn)定性.

圖2 TPPA-DBB的固體紫外吸收和熒光譜圖

圖3 不同濃度TPPA-DBB的紫外光譜圖

2.3 聚集誘導(dǎo)熒光特性

選取溶解性良好的溶劑甲醇和不良好的溶劑水作為混合溶劑體系.通過(guò)檢測(cè)TPPA-DBB在水和甲醇不同體積比溶液中的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)TPPA-DBB具有聚集誘導(dǎo)熒光特性，如圖4～圖6所示，水的體積分?jǐn)?shù)在0%～20%范圍時(shí)熒光變化并不明顯，而在水的體積分?jǐn)?shù)為20%～60%的范圍內(nèi)有明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，水的體積分?jǐn)?shù)在60%～95%的范圍時(shí)雖然熒光強(qiáng)度增加但是增加速率變小.最終檢驗(yàn)熒光強(qiáng)度倍數(shù)提高，最大熒光強(qiáng)度大約增加2倍.這說(shuō)明TPPA-DBB超分子熒光探針具有聚集誘導(dǎo)熒光特性.

2.4 DNA體外識(shí)別測(cè)試

測(cè)試TPPA-DBB超分子是否也具有對(duì)DNA熒光識(shí)別作用，首先采取體外實(shí)驗(yàn)的辦法進(jìn)行確定.發(fā)現(xiàn)TPPA-DBB與DNA結(jié)合后最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移，這說(shuō)明TPPA-DBB可以通過(guò)分子間作用力與DNA分子進(jìn)行結(jié)合，見(jiàn)圖7和圖8.在DNA低濃度范圍（0.06～1.00 mg）內(nèi)加入DNA的質(zhì)量與熒光發(fā)射強(qiáng)度成正比，當(dāng)加入DNA的質(zhì)量超過(guò)4 mg時(shí)發(fā)生飽和.

圖4 TPPA-DBB聚集誘導(dǎo)現(xiàn)象熒光光譜

圖5 TPPA-DBB在不同的水含量聚集誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度示意圖

圖6 TPPA-DBB聚集誘導(dǎo)現(xiàn)象圖

2.5 細(xì)胞毒性測(cè)試

以人體肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別對(duì)不同濃度的TPPA-DBB探針做了MTT實(shí)驗(yàn).如圖9（a）所示，細(xì)胞的存活率隨著TPPA-DBB探針濃度的增大而降低，最終細(xì)胞的存活度都在80%以上，表明化合物TPPA-DBB的加入對(duì)細(xì)胞的毒性傷害較小.在探針的濃度為10 mg/L的條件下，細(xì)胞存活度與空白對(duì)比只有很小的損失，當(dāng)探針濃度為20 mg/L時(shí)細(xì)胞仍具有90%以上存活率.以10 mg/L作為工作濃度考察了細(xì)胞代際存活率，見(jiàn)圖9（b），細(xì)胞在培養(yǎng)5代時(shí)仍有80%的存活率.

圖7 TPPA-DBB水溶液中對(duì)DNA熒光識(shí)別示意圖

圖8 TPPA-DBB和不同濃度DNA結(jié)合熒光強(qiáng)度線(xiàn)形擬合示意圖

圖9 毒性測(cè)試結(jié)果圖

2.6 細(xì)胞成像測(cè)試

使用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像的測(cè)試，結(jié)果如圖10所示，通過(guò)與DAPI做比對(duì)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察，TPPA-DBB最終停留在細(xì)胞核內(nèi)部并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行特定標(biāo)記.這說(shuō)明合成的TPPA-DBB超分子熒光探針可以很好地穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，并且通過(guò)細(xì)胞核的核孔進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)部與DNA結(jié)合發(fā)出明亮的熒光.在單色激發(fā)波長(zhǎng)下，可以很明顯地捕捉到熒光探針在細(xì)胞核內(nèi)駐留并且可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光.上述結(jié)果說(shuō)明TPPA-DBB是一種可以對(duì)細(xì)胞核染色的高靈敏度的超分子熒光探針.

圖10 TPP-DBB作用于A(yíng)549活細(xì)胞成像圖

3 結(jié)論

通過(guò)Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)和季銨鹽反應(yīng)制備了具有三苯胺三吡啶基團(tuán)的超分子熒光探針TPPA-DBB.TPPA-DBB超分子在混合溶液中表現(xiàn)出聚集誘導(dǎo)熒光性質(zhì)，其固體也有很大的斯托克位移.TPPA-DBB分子穩(wěn)定性好、易穿透細(xì)胞膜、細(xì)胞毒性低.作為超分子熒光探針可以有效地提高自身的電荷密度，大幅度提高與DNA的相互作用，與傳統(tǒng)的小分子熒光探針相比具有更高的靈敏度和更好的生物相容性.在細(xì)胞成像領(lǐng)域中TPPA-DBB可以實(shí)現(xiàn)對(duì)A549活細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行高靈敏度、高分辨率的成像.