趙麗華，黃程鵬，王悅悅，黃張婷

（浙江農(nóng)林大學(xué) 理學(xué)院，浙江 杭州 311300）

植物硅酸體，簡(jiǎn)稱植硅體，是植物內(nèi)的含水非晶態(tài)二氧化硅（SiO2）顆粒，存在于植物不同部位的細(xì)胞內(nèi)［1－2］。植硅體碳因具有很強(qiáng)的抗腐蝕、抗分解、抗氧化等特性［2－3］，可在土壤中保存數(shù)千年乃至萬(wàn)年之久［4］，是陸地生態(tài)系統(tǒng)長(zhǎng)期固碳的主要機(jī)制之一［5－6］，對(duì)調(diào)節(jié)全球碳平衡和應(yīng)對(duì)氣候變化意義重大。當(dāng)前對(duì)植硅體的研究主要集中于古環(huán)境與古氣候重現(xiàn)、農(nóng)業(yè)與環(huán)境考古、古生態(tài)以及植物分類學(xué)等方面，基于宏觀估測(cè)和默認(rèn)植硅體恒久穩(wěn)定的前提進(jìn)行，因此學(xué)界對(duì)土壤中植硅體的穩(wěn)定性存在很大爭(zhēng)議。PARR等［7－8］發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過(guò)2 000 a的分解，土壤中植硅體碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)從僅占表層土壤有機(jī)碳不到10%的比例，上升到82%，表明土壤中植硅體碳的封存是一個(gè)長(zhǎng)期積累的過(guò)程［9］。WILDING等［4］發(fā)現(xiàn)：植硅體中碳的放射性年齡約為1.33萬(wàn)a。因此，植硅體具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。也有研究認(rèn)為植硅體是不穩(wěn)定的。如FRAYSSE等［10］發(fā)現(xiàn)竹林土壤中的植硅體的溶解度等同于玻璃質(zhì)硅石，是石英的17倍；BARTOLI等［11］認(rèn)為植硅體的溶解速率比硅酸鹽礦物高一個(gè)數(shù)量級(jí)［11］；CONLEY等［12］發(fā)現(xiàn)：保存死亡植物的地方，水溶性硅的輸出明顯增加。竹類作為禾本科Poaceae中典型的硅富集植物，植硅體碳含量高，提取、純化相對(duì)方便［13－14］。其次，竹類植物分布廣泛，種類豐富［15］，不同生境竹種差異大［16］，為比較不同竹種植硅體碳穩(wěn)定性差異和微觀形態(tài)特征提供了理想的材料。選擇竹類植物為研究對(duì)象，對(duì)揭示植硅體碳穩(wěn)定性機(jī)理和準(zhǔn)確估測(cè)竹類植硅體碳封存潛力具有雙重意義。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）是由電子光學(xué)技術(shù)、真空技術(shù)、精細(xì)機(jī)械結(jié)構(gòu)以及現(xiàn)代計(jì)算機(jī)控制技術(shù)等共同組成的電子光學(xué)儀器［17］，在植物研究工作中主要被應(yīng)用于植物來(lái)源和種類鑒定、植物微形態(tài)學(xué)研究以及植物生長(zhǎng)的優(yōu)劣與環(huán)境污染等質(zhì)量控制［18－19］。近年來(lái)，隨著植物和土壤植硅體碳研究的深入，掃描電子顯微鏡等先進(jìn)儀器也被應(yīng)用到植硅體碳測(cè)定上［20－21］。本研究以毛竹Phyllostachys edulis葉片為材料，利用掃描電子顯微鏡的高清成像功能檢測(cè)植硅體微觀形態(tài)特征，從微觀形態(tài)上研究毛竹植硅體的穩(wěn)定性，建立植硅體穩(wěn)定性微觀表征方法，為深入開(kāi)展植硅體碳研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毛竹植硅體樣品制備

1.1.1 毛竹葉片樣品采集 在野外調(diào)查基礎(chǔ)上，采集杭州市臨安區(qū)青山鎮(zhèn)毛竹葉片約500 g。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，用軟毛筆輕掃除去表面灰塵和其他雜物，過(guò)程中需注意不損傷毛竹葉片樣品。用吹氣球吹凈后，蒸餾水進(jìn)行清洗。在105℃下殺青20 min，再在75℃下烘24 h以上，磨碎備用。

1.1.2 植硅體提取 采用微波消解法、濕灰化法和干灰化法提取毛竹葉片中植硅體。①微波消解法：稱取毛竹葉片樣品 0.300 0 g，加4.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%的硝酸（HNO3），3.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過(guò)氧化氫（H2O2），1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸（HCl），置于微波消解儀中，消解2 h后取出，離心清洗［7］。提取后的植硅體，采用Walkley-Black法［22］確保除去植硅體外殘留的有機(jī)碳等物質(zhì)。65℃烘干24 h。②濕灰化法：取0.100 0 g毛竹葉片樣品，置于100 mL燒杯，加入約10.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%的硝酸（HNO3），于電熱板上緩慢加熱，使樣品內(nèi)有機(jī)質(zhì)逐漸被氧化，直至有機(jī)質(zhì)氧化完全，樣品不再呈黏稠，溶液澄清為止。再加入2 mL 100 g·kg－1的稀鹽酸清洗，以去除附著的鈣離子；去離子水清洗2次，無(wú)水乙醇清洗2次，65℃烘干24 h。③干灰化法：取0.100 0 g毛竹葉片樣品置于500℃的馬弗爐中灰化6 h，取出，再加100 g·kg－1的稀鹽酸清洗，溶解灰分中的鈣離子，離心清洗2次，65℃烘干24 h。。

1.1.3 植硅體溶解度試驗(yàn) 稱取微波消解法提取的純凈毛竹葉植硅體50 mg，放入50 mL的塑料離心管中，加入0.4 mol·L－1的硼酸緩沖液45.0 mL（pH 10，浸泡用）。搖勻后放置于恒溫振蕩機(jī)中，設(shè)置溫度為50℃，振動(dòng)頻率為70 r·min－1，振蕩15 d。抽取搖勻的懸濁液1 mL置于微量離心管中，10 000 r·min－1離心10 min；在含有植硅體的沉淀中加入超純水，10 000 r·min－1清洗10 min，直到清洗干凈。沉淀烘干后備用。

1.2 植硅體掃描電鏡分析前處理

稱取 20 mg已提取的植硅體樣品，分散在100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 g·kg－1的甘油中；用定量吸管吸取0.01 mL制樣，紅外線燈烘干。采用離子濺射鍍覆法進(jìn)行植硅體樣品鍍膜。將上述烘干后的植硅體樣品粉末均勻地撒在卡片紙上，用粘有導(dǎo)電膠的掃描電鏡樣品臺(tái)沾取樣品。樣品及樣品臺(tái)置于BC-Ⅱ離子濺射儀中進(jìn)行真空噴鍍,噴鍍時(shí)金靶材處于陰極，調(diào)整靶材和樣品臺(tái)合適的距離，抽真空后通入微量氮?dú)?。兩極間加電場(chǎng)后產(chǎn)生輝光放電，并調(diào)節(jié)電流大小。重復(fù)多次至獲得最佳的鍍膜真空度和電流值。

1.3 電鏡觀察

前處理完成后，放入場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡中（型號(hào)為SU-8000 Hitachi）；調(diào)節(jié)燈絲飽和點(diǎn)、光闌對(duì)中、光闌合軸、消象散調(diào)節(jié)和聚焦觀測(cè)等，可獲得清晰的表面形貌植硅體微觀表面形貌圖像。

2 結(jié)果分析

2.1 3種不同方法提取的植硅體的微觀形態(tài)特征

由圖1A可見(jiàn)：微波消解法提取的毛竹植硅體長(zhǎng)為12～14 μm，寬為7～10 μm；植硅體呈現(xiàn)長(zhǎng)鞍形（竹節(jié)形），圖像細(xì)節(jié)清晰，植硅體形態(tài)完整，說(shuō)明微波消解法是一種獲得植硅體理想形貌的方法。用干灰化法（圖1B）和濕灰化法（圖1C）提取的毛竹植硅體，除長(zhǎng)鞍形外，還觀察到啞鈴形；植硅體長(zhǎng)為12 μm，連接處寬度為4 μm，兩端的寬度為8 μm；用濕灰化法提取的毛竹植硅體還可見(jiàn)微小突起（圖1C）。

圖1 單個(gè)植硅體掃描電子顯微鏡圖片F(xiàn)igure 1 SEM graph of phytolith

由圖1可知：3種提取毛竹植硅體的方法均能獲得清晰的植硅體微觀形態(tài)，但相比而言，微波消解法所展現(xiàn)的細(xì)節(jié)最為豐富、清晰，可以觀察到植硅體表面的溶蝕坑、破碎、粗糙度等微形態(tài)變化特征，能保留植硅體的細(xì)節(jié)形貌不被破壞。因此，微波消解法為最佳提取方法，更有利于探究植硅體的微觀形貌及其穩(wěn)定性。

2.2 植硅體穩(wěn)定性的電鏡分析

微波消解法提取的植硅體經(jīng)pH 10的硼酸緩沖液中浸泡15 d后微觀形態(tài)發(fā)生變化。從圖2A可以看出：未經(jīng)浸泡的毛竹植硅體呈現(xiàn)棒狀，沒(méi)有彎曲和分叉，表面較為光滑。浸泡15 d后的植硅體（圖2B）樣品表面變粗糙，出現(xiàn)溶蝕坑；內(nèi)部硅質(zhì)顆粒暴露，清晰可見(jiàn)其呈聚集分布。由此認(rèn)為植硅體并非惰性，其不穩(wěn)定性從外表面開(kāi)始被破壞；掃描電鏡圖像驗(yàn)證了 “植硅體有可能不穩(wěn)定”的結(jié)論。

目前對(duì)植硅體穩(wěn)定性的判斷還沒(méi)有統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因此如何尋求有效方式快速了解植硅體的穩(wěn)定性成為研究者急需解決的問(wèn)題之一。本研究結(jié)果認(rèn)為：掃描電鏡作為一種直觀探測(cè)方式，可以觀測(cè)到植硅體表面的微形態(tài)變化，可為植硅體穩(wěn)定性的研究提供依據(jù)和輔助判別方法。

圖2 微波消解法提取的植硅體浸泡前后的微觀形態(tài)變化Figure 2 Micromorphological changes of the phytolith extracted by microwave digestion method before and after soaking

3 結(jié)論

微波消解法是提取毛竹植硅體比較理想的方法，可以觀察到植硅體表面的溶蝕坑、破碎、粗糙度等微形態(tài)變化特征。對(duì)微波消解法提取的毛竹植硅體，經(jīng)pH 10的硼酸緩沖液中浸泡15 d后進(jìn)行掃描電鏡觀測(cè)，能觀察到毛竹植硅體在浸泡后的不穩(wěn)定狀態(tài)，驗(yàn)證了 “植硅體不穩(wěn)定”的說(shuō)法。