伍寶朵，胡麗松，范 睿，楊建峰，郝朝運

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所, 海南 萬寧 571533; 2. 農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室, 海南 萬寧 571533; 3. 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點實驗室, 海南 萬寧 571533)

【研究意義】胡椒(Pipernigurm)是世界上最重要的香辛料作物，具有較高的經(jīng)濟價值[1-2]。目前胡椒種植已遍及亞州、非州、拉丁美洲近20個國家和地區(qū)，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，世界胡椒收獲面積近50萬hm2，總產(chǎn)量達45.4萬t。中國胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等省(區(qū))，種植面積達3萬hm2，年產(chǎn)量約3.60萬t，位居世界第五[3]，其中海南是胡椒主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均占全國90 %以上。隨胡椒價格攀升，我國胡椒種植面積不斷擴大，以云南省胡椒種植面積發(fā)展最為迅速[4]。近年來，寒害等極端氣候頻發(fā)，我國胡椒主栽胡椒品種熱引1號胡椒不耐低溫，受寒害后易出現(xiàn)落葉、斷枝，甚至死亡，且傷口極易感染病害，易對胡椒產(chǎn)量造成嚴重影響[5-6]。因此，選育適合中國氣候環(huán)境特點的高產(chǎn)、抗寒新品種是產(chǎn)業(yè)發(fā)展迫切需要解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】An等[7]研究表明CBF/DREB1低溫調(diào)控途徑是植物抵御寒害的重要調(diào)節(jié)途徑。CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子是植物特有AP2/EREBP結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，通過識別啟動子區(qū)含有CRT/DRE元件的低溫響應基因，從而激活基因轉(zhuǎn)錄[8]。AtCBFs基因在低溫脅迫15 min后表達量增加，擬南芥中約12 %～20 %低溫響應基因是被AtCBF1-3激活，包括COR基因、其他轉(zhuǎn)錄因子(RAP2.1)、滲透物質(zhì)(脯氨酸、糖類、丙二醛等)合成酶等[8-9]。與AtCBF1相比，MeCBF1在低溫脅迫4 h后才上調(diào)表達，擬南芥中過量表達MeCBF1也可增強其抗寒能力[10]。單、雙子葉植物的CBF1基因具有相似的結(jié)構(gòu)和保守的功能，在擬南芥中過量表達水稻[11]、樺木[12]及葡萄CBF1基因[13]也能夠提高擬南芥抗寒性?！颈狙芯壳腥朦c】綜上所述，CBF/DREB1低溫調(diào)控途徑在植物抵御寒害中發(fā)揮了重要作用，在多種作物中已克隆并證明CBF1在植物抵御寒害中的作用。但胡椒中尚未見抗寒相關(guān)基因克隆的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過同源序列法從胡椒中克隆CBF1基因，分析其表達模式，為今后胡椒抗寒分子機制研究奠定基礎，對胡椒抗寒育種和基因遺傳改良具有重要的理論及現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 供試材料為熱引1號胡椒(低溫敏感)和石南藤(低溫耐受)，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所“農(nóng)業(yè)部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃”。按照海南省地方標準“胡椒優(yōu)良種苗培育技術(shù)規(guī)程”(DB46/T26-2012)，選取生長正常、無病蟲害和機械損傷的熱引1號胡椒和石南藤插條，在溫室沙床中培育生根，生根后轉(zhuǎn)移至育苗袋中撫育3個月，轉(zhuǎn)移至人工氣候箱KBWF720(賓德，德國)中進行低溫處理。試驗設置4 ℃低溫脅迫，光照設置為12 h /12 h，相對濕度保持70 %左右，待溫度降至待處理溫度后開始計時。分別在低溫脅迫0、12、24、48、72 h 采集葉片并迅速置于液氮中冷凍，將采好的樣品保存于-80 ℃冰箱備用。重復3次，每次重復處理5株苗。

1.1.2 菌株及試劑 RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α菌株購自天根生化科技(北京)有限公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司，SYBR Green qRT-PCR試劑盒購自TOYOBO公司，測序和引物合成委托上海英駿生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取、cDNA合成及胡椒CBF1基因克隆 提取胡椒組織總RNA，操作參照試劑盒提取方法。取2 μg RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體方法參照說明書。胡椒EST數(shù)據(jù)庫(SRX708503)與Genbank上公布的模式植物CBF1序列進行tBlastn搜索，依據(jù)搜索獲得的CL5815.Contig1_All序列，利用Primer Primer 5軟件設計擴增ORF特異性引物CBF22-F: 5′-TCCGACTTCTAAAAATGGCAAC-3′、CBF22-R: 5′-TTAAATGCTCAA ACAGAGTGG-3′。以熱引1號胡椒和石南藤根、莖、老葉、嫩葉、花組織cDNA等量混合樣為模板擴增，PCR體系為50 μl，PCR擴增參數(shù)為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小正確后，回收純化目的條帶，連接pMD18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性克隆測序。

1.2.2 胡椒CBF1基因生物信息學分析 ORF和氨基酸序列分析分別利用NCBI ORF finder程序和在線網(wǎng)站(http://web.expasy.org/translate/)。利用在線網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)預測CBF1基因蛋白理化性質(zhì)，亞細胞定位使用PSORT Prediction進行分析。然后在NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫中利用blastp搜索其他植物的CBF1并獲取其序列，利用軟件DNAMAN 6.0進行序列比對，利用MAGE4.0分析CBF1系統(tǒng)的進化關(guān)系。

1.2.3 胡椒CBF1基因的表達分析 根據(jù)胡椒CBF1基因的開放閱讀框序列設計實時熒光定量引物qCBF22a-F: 5′-CAGCAGCTCCCATGTCAGTC-3′、qCBF22a-R: 5′-TCTGCGGTCGGGTGAGTG-3′; 以胡椒管家基因Polyubiquitin1作內(nèi)參，內(nèi)參引物為PUB1-F:5′-TTACCAGGACTCAGCAGCGAATG-3′、PU B1-R: 5′-AAGCCAATGACTTTACATCCTCCAG-3′[14]，實時熒光定量PCR在Life technologies QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀上進行，PCR反應體系為20 μl，按照SYBR Premix ExTaqTM II試劑說明書進行。擴增參數(shù)為經(jīng)典的2步法：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)，每個樣品重復4次，根據(jù)Ct值計算基因表達豐度，基因的相對表達量計算采用2-△△CT方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒CBF1基因全長cDNA克隆

以熱引1號胡椒和石南藤根、莖、老葉、嫩葉、花組織cDNA等量混合樣為模板，利用特異性引物CBF22進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示獲得約670 bp條帶(圖1)。經(jīng)純化、轉(zhuǎn)化測序得到基因全長序列，通過GenBank Blast搜索比對，顯示結(jié)果為AP2/EREBP結(jié)合蛋白(CBF1)，與白樺CBF1蛋白同源性達到54 %。該序列包含啟始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，在熱引1號胡椒中ORF全長為660 bp，命名為PnCBF1，編碼220個氨基酸，石南藤中ORF全長為654 bp，命名為PwCBF1，編碼218個氨基酸。

2.2 胡椒CBF1基因生物信息學分析

在熱引1號胡椒和石南藤中，CBF1基因編碼的氨基酸序列分子量分別為24.07和23.87 kD，等電點PI為4.82，分子式分別為C1057H1602N298O323S13和C1052H1599N295O321S11。預測蛋白的氨基酸組成中，氨基酸出現(xiàn)頻率較高的是Ala、Glu Arg和Gly，在熱引1號胡椒中分別占總氨基酸的14.6 %、8.7 %、7.8 %和8.7 %，在石南藤中分別占總氨基酸的15.7 %、9.2 %、7.4 %和7.4 %，Pyl和Sec則沒有出現(xiàn)。分析發(fā)現(xiàn)胡椒CBF1具有56個氨基酸殘基組成AP2 /EREBP結(jié)構(gòu)域，2個保守的氨基酸序列位于AP2結(jié)構(gòu)域的上游和下游，分別是PKK/RRAGRKKFRETRHP和DSAWR，其中PKK/RRAGRKKFRETRHP是核定位信號序列(NILs) (圖2，封三)。通過NCBI Blast檢索與胡椒CBF1基因編碼氨基酸同源的序列，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建CBF1基因氨基酸序列進化樹(圖3)。結(jié)果表明，19種植物的CBF1被分成兩個亞族(ClassⅠ和ClassⅡ)，ClassⅠ是由16種植物(包含橡膠、番茄等在內(nèi))的CBF1組成，ClassⅡ是由3種植物(水稻、玉米和二穗短柄草)的CBF1組成， PnCBF1和PwCBF1歸屬于該類，胡椒的CBF1與檀香的距離較近，與薔薇科的蘋果進化距離較遠。

熱引1號胡椒：Reyin-1；石南藤：SNTPiper nigrum cv. Reyin-1: Reyin-1; Piper wallichii: SNT圖1 PCR擴增胡椒CBF1基因的瓊脂糖凝膠擴增結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of PCR product of CBF1 gene in Piper L.

2.3 胡椒CBF1基因表達分析

以胡椒Polyubiquitin1基因作內(nèi)參，以熱引1號胡椒根部樣品為對照，利用熒光定量PCR技術(shù)分析CBF1基因在胡椒不同組織中的表達模式。由圖4可知，CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤不同組織中表達量差異較大，在熱引1號胡椒根、老葉、嫩葉、莖、花和石南藤老葉、嫩葉、莖、花中表達量極少，而在石南藤根中的表達量是熱引1號胡椒根的198.14倍。

以胡椒Polyubiquitin1基因作內(nèi)參，以低溫脅迫熱引1號胡椒4 h的樣品為對照，分析低溫脅迫不同時期熱引1號胡椒和石南藤葉片中CBF1基因表達特征(圖5)。結(jié)果表明：在低溫脅迫前，CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤的表達量均較低；4 ℃低溫脅迫后，2個種質(zhì)的表達量都顯著增加，在熱引1號中胡椒中，CBF1基因表達量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，其中脅迫48 h表達量最高，是對照的6.54倍，是脅迫前表達量的251.34倍；在石南藤中，CBF1基因表達量呈現(xiàn)雙峰波動的變化趨勢，脅迫4 h表達量達到最高，是對照的81.02倍，是脅迫前表達量的28.97倍。低溫脅迫不同時期中，CBF1基因在石南藤中的表達量都顯著高于熱引1號胡椒，其中脅迫4 h時表達量差異最大。

3 討 論

栽培胡椒起源或長期生長在熱帶、南亞熱帶地區(qū)，抗寒能力較弱，而我國胡椒種植在海南、云南、廣東和廣西各省，由于地理位置均存在不同程度的寒害問題。通過多年田間調(diào)查、盆栽試驗表型和生理生化指標測定，在栽培胡椒種內(nèi)未鑒定出抗寒的種質(zhì)，從具有優(yōu)良表型的近緣野生種著手，克隆抗寒關(guān)鍵基因，分析并進行功能驗證，可為胡椒抗寒分子育種提供優(yōu)異基因資源。植物感受低溫信號誘導下游調(diào)控路徑非常復雜，目前CBF/DREB1低溫調(diào)控途徑被學術(shù)界廣泛認可。CBF同源基因已在多種低溫耐受作物(小麥、大麥及油菜)[15-17]和低溫敏感

圖3 胡椒CBF1與其他植物CBF1氨基酸序列進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of CBF1s from Piper L. with other CBFs

作物(水稻、玉米及番茄)[11, 18]中克隆。研究表明，CBF轉(zhuǎn)錄因子對基因的調(diào)控作用在不同植物物種的冷馴化進化中起著舉足輕重作用。目前還沒有關(guān)于胡椒抗寒分子機理方面的研究，本研究首次從胡椒寒害問題入手，克隆并表達分析CBF1基因為胡椒抗寒關(guān)鍵基因的挖掘奠定了基礎。

CBF1基因?qū)儆贏P2/ERF (APETALA2/Ethylene responsive factor)轉(zhuǎn)錄因子家族的一類成員，該家族基因編碼約由58個氨基酸殘基組成AP2 /EREBP 結(jié)構(gòu)域和2個保守的氨基酸序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)，保守氨基酸序列分別位于AP2 /EREBP 結(jié)構(gòu)域的上游和下游。本研究克隆出的胡椒CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤中的開放讀碼框分別為660和654 bp，分別編碼220和218個氨基酸，具有同其他物種CBF1相似的保守結(jié)構(gòu)域[14, 19]。通過氨基酸序列進化分析發(fā)現(xiàn)，19種植物的CBF1被分成2個亞族，ClassⅠ是由16種植物雙子葉植物組成， ClassⅡ是由3種單子葉植物組成，胡椒CBF1屬于ClassⅡ，表明CBF1基因在單雙子葉植物分化前已經(jīng)分化，之后隨著物種的演化而進化。

圖4 CBF1基因組織特異性表達分析Fig.4 Transcription pattern analysis of CBF1 in different tissues from Piper nigrum cv. Reyin-1 and Piper wallichi

在組織特異性表達研究中發(fā)現(xiàn)，CBF1基因在熱引1號胡椒根、老葉、嫩葉、莖、花和石南藤老葉、嫩葉、莖、花中表達量極少，而在石南藤根中的表達量最高。在冰島罌粟中，PnDREB1在花瓣，花梗，葉，葉柄，和根中都有表達，以根中表達量最高[20]。An等發(fā)現(xiàn)MeCBF1在木薯各組織中表達量也很低，其中在嫩莖中表達量最高，頂芽和莖形成層中表達量最低[10]。而AtCBF1基因在擬南芥根、莖、葉中均無表達[21]。通過以上研究可以推測CBF1基因在不同物種的進化中作用不同。

低溫脅迫下，受Ca2+信號誘導，CBF/DREB1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物迅速積累，識別COR基因等低溫響應基因啟動子區(qū)的CRT/DRE元件，激活基因表達，從而增強植物對低溫逆境的抗性。在本研究中，低溫脅迫前，CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤中的表達量均較低，低溫脅迫后，CBF1基因在2個種質(zhì)中的表達量均顯著增加，且在不同脅迫時間其表達量顯著差異。說明CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤中受低溫誘導表達，且表達量與脅迫時間相關(guān)。研究結(jié)果顯示，低溫脅迫4 h時，2個種質(zhì)中CBF1基因的表達量分別是脅迫前的251.34和81.02倍，在熱引1號胡椒中，脅迫48 h時CBF1基因表達量最高，而在石南藤中，脅迫4 h時CBF1基因表達量最高，隨后顯著性下降。表明低溫脅迫后，CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤中表達最高峰出現(xiàn)的時期不同，低溫耐受種質(zhì)石南藤的CBF1基因表達量在不同時期均顯著高于低溫敏感種質(zhì)熱引1號胡椒，這反映了2個種質(zhì)對低溫脅迫反應速度不同，表達量差異較大。在擬南芥中，CBF1基因在低溫脅迫15 min后已經(jīng)被誘導表達，2 h時表達量達到最高[22-23]。在冰島罌粟中，PnDREB1在低溫脅迫2 h表達量顯著上升，8 h達到峰值，12 h后表達量降低到脅迫前水平[20]。這反映出不同物種CBF1基因?qū)Φ蜏孛{迫反應存在一定的差異。本研究中胡椒CBF1基因的克隆和表達分析為胡椒CBFs低溫調(diào)控途徑研究和抗寒分子機制研究奠定了基礎。

圖5 低溫脅迫不同時期CBF1基因表達分析Fig.5 The expression analysis of CBF1 gene under low temperature in Piper nigrum cv. Reyin-1 and Piper wallichi

4 結(jié) 論

從熱引1號胡椒和石南藤中克隆獲得PnCBF1和PwCBF1，開放讀碼框長度分別為660和654 bp。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明CBF1基因在石南藤的根組織中高量表達，而在熱引1號胡椒和石南藤的其他組織中均低量表達；低溫脅迫后，CBF1基因在熱引1號胡椒和石南藤中均受低溫誘導表達，且在低溫耐受種質(zhì)石南藤中的表達量顯著高于低溫敏感種質(zhì)熱引1號胡椒。