肖龍敏，唐 明，張好強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬落葉小灌木[1]，主要生長在我國西北荒漠區(qū)，果實(shí)(枸杞子)具有極高藥用價(jià)值及營養(yǎng)價(jià)值，是絲綢之路藥用植物的典型代表。同時(shí)，寧夏枸杞具有抗旱耐鹽堿、耐寒耐瘠薄等特點(diǎn)，加之植株生長迅速、枝葉繁茂、根系發(fā)達(dá)，因此，在我國西北干旱荒漠區(qū)水土保持、荒山治理及土壤鹽堿化改良中得以廣泛種植。

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是一類能與陸地上超過80%的植物形成互惠共生體的土壤微生物。AM真菌可與宿主植物進(jìn)行養(yǎng)分交換、能量流動和信息傳遞，增加植物抗逆性。國內(nèi)外研究表明，AM真菌能夠促進(jìn)植物生長，提高植物吸收水分、養(yǎng)分[2-4]能力、增強(qiáng)植物抗逆性和改善植物品質(zhì)[5-6]。J.L.Harley[7]等首次發(fā)現(xiàn)枸杞(L.barbarum)可形成叢枝菌根。盛敏[8]等在研究寧夏鹽堿地植物菌根類型中，發(fā)現(xiàn)枸杞形成叢枝菌根，并有較高侵染率。張海涵[9]等發(fā)現(xiàn)接種AM真菌和DSE能夠有效地促進(jìn)枸杞根系發(fā)育，通過提高枸杞葉片氣孔導(dǎo)度和光合速率來減輕干旱脅迫的毒害作用。劉洪光[10]等在寧夏鹽土枸杞(L.barbarum)和沙棗(Elaeagnusangustifolia)2種植物根際鹽土中鑒定出33種AM真菌，其中，來自球囊霉科(Glomeraceae)的AM真菌種類最多，表明寧夏鹽土中具有很高的AM真菌群落多樣性。劉洪光[11]等認(rèn)為接種Glomusversiforme通過調(diào)節(jié)枸杞激素，能夠顯著緩解鹽脅迫對枸杞生長的抑制作用，提高枸杞滲透調(diào)節(jié)能力，促進(jìn)枸杞根系的生長發(fā)育，保證枸杞對水分和養(yǎng)分的吸收功能。胡文濤[12-13]等認(rèn)為AM真菌通過對水分管理和調(diào)節(jié)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白滿足枸杞對無機(jī)磷酸鹽的需求，能夠顯著緩解干旱脅迫對枸杞生長的抑制作用，增強(qiáng)枸杞對非生物脅迫的耐受能力。李越鯤[14]等通過對枸杞根際土壤真菌群落多樣性的高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)枸杞可與球囊菌門(Glomeromycota)真菌形成叢枝菌根，說明枸杞根際AM的形成是比較普遍的現(xiàn)象。杜曉寧[14]等對寧夏枸杞內(nèi)生細(xì)菌的多樣性研究表明枸杞內(nèi)生細(xì)菌大多屬于土壤土著細(xì)菌，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬等。納小凡[16]等研究表明，寧夏枸杞根際更易聚集變形菌門和放線菌門細(xì)菌，并存在固氮菌和解磷菌。

目前，針對寧夏枸杞的研究主要集中在寧夏枸杞抗逆性、枸杞子經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值上，然而從土壤生態(tài)系統(tǒng)角度看，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與寧夏枸杞種植年限、土壤因子的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究利用巢式PCR-DGGE和克隆測序技術(shù)研究了寧夏鹽土中不同種植年限寧夏枸杞根際微生物群落多樣性及其與AM真菌侵染率和土壤因子的關(guān)系，有望篩選出抗鹽效果更高的菌種，促進(jìn)AM真菌在鹽漬化土壤中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)位于寧夏銀川，該地區(qū)是我國枸杞之鄉(xiāng)，屬典型溫帶大陸性氣候，晝夜溫差大，日照時(shí)間長。土壤以灰鈣土、白疆土和鹽土為主，土壤鹽漬化嚴(yán)重。植被主要以寧夏枸杞和沙棘為主，具有30多a的種植歷史。

本試驗(yàn)選取寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所苗圃樣地不同樹齡(5、10、15 a和24 a)的寧夏枸杞為研究對象，采樣時(shí)間為2016年6月。土樣樣品采集方法如下：利用抖根法收集寧夏枸杞根際土壤[17]，在每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)布設(shè)3個(gè)樣方(10 m×10 m)，每個(gè)樣方隨機(jī)選取5棵植株。在每棵植株周圍選取5個(gè)采樣點(diǎn)，采集土樣。將每棵樹的5個(gè)土樣混勻，以消除植株根際土壤的差異。用干凈的鑷子和刷子將根系表面土壤分離收集，作為根際土，用干凈的鑷子從土壤中小心剝離細(xì)根并收集起來。將樣品裝入自封袋，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)和植物周圍環(huán)境。采集的根樣和土樣立即放入4℃冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。土樣過2 mm篩，除去動物殘?bào)w和石塊等雜物。將過篩后土樣-20℃保存，用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究及理化性質(zhì)測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

將采集土樣風(fēng)干、過篩后，按照戴萬宏[18]等的方法測定土壤pH。速效鉀(AK)采用火焰光度計(jì)測定。速效磷(AP)通過0.5 mol·L-1碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，提取物用分光光度計(jì)(Hitachi，UV2300)在660 nm波長下測定吸光值。銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)含量采用2 mol·L-1KCl浸提，流動分析儀測定[19]。

1.3 AM真菌侵染率和孢子密度測定

AM真菌侵染率參照Phillips and Hayman的方法測定，用清水沖洗根系，剪取部分根系放于FAA固定液中，經(jīng)曲利苯藍(lán)染色后[20]，采用十字交叉法測定AM真菌侵染率。

侵染率=(交叉點(diǎn)上菌根數(shù)/總交叉點(diǎn)數(shù))×100%

從每份土壤樣品中取100 g風(fēng)干土，采用濕篩傾析法進(jìn)行AM真菌孢子分離，在體視顯微鏡下記錄AM真菌的孢子數(shù)量，統(tǒng)計(jì)孢子密度(Spore density，SD)[21]。

SD=AM真菌孢子數(shù)量/土樣質(zhì)量

1.4 土壤微生物DNA的提取及擴(kuò)增

1.4.1 土壤微生物DNA的提取 采用E.Z.N.A.土壤DNA提取試劑盒(Omega，USA)提取樣地根際土壤DNA，-20℃保存。DNA純度和濃度利用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies，DE)測定，DNA質(zhì)量用溴化乙錠(EB)(Sigma，USA)染色，瓊脂糖(Invitrogen，USA)凝膠電泳檢測。采用E.Z.N.A.DNA膠回收試劑盒(Omega，USA)對樣品基因組DNA進(jìn)行純化。

1.4.2 巢式PCR擴(kuò)增 16S rRNA基因V3區(qū)的擴(kuò)增：將純化后基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板，使用美國Bio-Rad公司基因擴(kuò)增儀，采用對大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)具有特異性引物341F-GC和534R，序列分別為341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)；GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)為(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG- CACGGGGGG-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約190 bp。

18S rRNA基因的擴(kuò)增：將純化后基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板，使用美國Bio-Rad公司的基因擴(kuò)增儀，采用對18S rRNA基因具有特異性的引物，第1輪所用引物是NS1和NS4，第2輪所用引物是AMV4.5NF-GC和AMDGR，序列分別為：NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)，NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約1 000 bp；AMV4.5NF(5′-AAGCTCGTAGTTGAATTCG-3′)，AMDGR(5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約300 bp。

PCR反應(yīng)體系：第1輪巢式PCR：10 μL 2×Taq Master Mix(康為公司)，0.5 μL 10 μM上、下游引物(Invitrogen，USA)，1 μL模板和8 μL RNase-Free Water。第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪PCR的模板。第2輪巢式PCR：25 μL 2×Taq Master Mix(康為公司)，1 μL 10 μM上、下游引物(Invitrogen，USA)，1 μL模板和22 μL RNase-Free Water。所用PCR儀為S1000TM Thermal cycler(Bio-Rad，USA)。

PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min預(yù)變性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物及引物特異性均通過EB染色瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(1.0%(w/v)瓊脂糖100 V 50 min)，DNA Marker為DL2000(康為公司)。

1.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

1.5.1 DGGE變性梯度膠的制備 DGGE膠在8%(w/v)聚丙烯酰胺膠(37.5∶1丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)中添加線性梯度變性劑，變性劑濃度由上到下、從低到高成線性梯度。變性劑由尿素和去離子甲酰胺組成(表1)。細(xì)菌變性梯度為30%～60%，AM真菌變性梯度為15%～30%。不同濃度的變性梯度膠按表2所示比例各配100 mL，4℃保存待用。上樣量為40 μL，運(yùn)行條件為：1×TAE電泳緩沖液，先在75 V電泳20 min，然后用120 V電泳5 h，電泳液溫度保持58℃；電泳完畢，取下凝膠板，將膠條放入EB染液中染色10 min，凝膠成像儀上(Molecular Imager Gel Doc TM XR System 170-8170，Bio-Rad，USA)拍照、保存。

表1 變性劑的配置比例

表2 變性梯度膠的配置比例

1.5.2 DGGE條帶的序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將DGGE膠上單一條帶切下，放入無菌PCR管中，編號，在無菌操作臺中，在PCR小管中加入30 μL無菌水，4℃放置24 h，使DNA從膠里面析出。使用不含GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物341F和534R再次擴(kuò)增細(xì)菌目的片段，使用不含GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物AMV4.5NF和AMDGR再次擴(kuò)增AM真菌目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物使用DNA純化試劑盒(天根生化有限公司)純化、回收后與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，送北京奧科生物技術(shù)有限公司測序。所測得序列用DNAMAN去除載體序列和GC夾后，將有效序列在NCBI上進(jìn)行比對，以其中同源性最高的序列確定為參照菌株，相似性≥97%進(jìn)行比的序列視為同一序列型(sequence type)[22]，使用MEGA5根據(jù)Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 細(xì)菌和真菌的多樣性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Quantity One軟件將條帶的亮度轉(zhuǎn)換為峰密度值，根據(jù)峰密度值及以下公式計(jì)算微生物群落的香農(nóng)指數(shù)(H′)、豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(Eh)和辛普森指數(shù)(D)。計(jì)算公式如下：

Eh=H/Hmax=H/lnS

式中，Ni表示第i條泳道峰密度值，N表示每個(gè)泳道中所有條帶的峰密度值總和，S表示每個(gè)泳道總條帶數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示。使用SPSS20.0生物統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Person法兩兩相關(guān)分析，用MEGA5.1建立Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表3可知，不同樹齡根際土壤pH呈弱堿性，pH為7.96～8.38，10、15 a和24 a寧夏枸杞根際土壤pH差異性顯著。寧夏枸杞根際土壤速效磷和速效鉀含量10年生最高(47.14 mg·kg-1和39.56 mg·kg-1)，15年生寧夏枸杞根際土壤中含量最低(25.35 mg·kg-1和17.53 mg·kg-1)，且顯著低于其他樹齡寧夏枸杞。不同樹齡寧夏枸杞根際土壤中硝態(tài)氮含量存在顯著差異，10年生寧夏枸杞根際土壤中硝態(tài)氮含量最高(139.80 mg·kg-1)，且顯著高于其他年齡，24年生寧夏枸杞根際土壤中硝態(tài)氮含量最低(18.48 mg·kg-1)。24年生寧夏枸杞根際土壤中銨態(tài)氮含量最高(13.69 mg·kg-1)，與其他年齡根際土壤中銨態(tài)氮含量差異性顯著。

表3 不同種植年限寧夏枸杞根際土壤理化性質(zhì)

注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同行不同小寫字母表示Duncan檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。AK，速效鉀；AP，速效磷；NO3--N，硝態(tài)氮；NH4+-N ，銨態(tài)氮。

2.2 菌根侵染率與孢子密度

不同樹齡寧夏枸杞根系均有AM真菌侵染(表4)，平均總侵染率為41.3%～49.3%，不同樹齡總侵染率不同，但是無明顯差異。不同樹齡寧夏枸杞平均菌絲侵染率為17.7%～27.7%，其中10 a寧夏枸杞菌絲侵染率最低。不同樹齡寧夏枸杞平均叢枝侵染率為6.6%～10.3%，其中10 a寧夏枸杞叢枝侵染率最高。不同種植年限寧夏枸杞孢子侵染率和泡囊侵染率均無明顯差異，隨著樹齡的增長，孢子侵染率和泡囊侵染率皆呈一定的下降趨勢，在24 a時(shí)泡囊侵染率僅為1%。不同樹齡寧夏枸杞的孢子密度為14.3～20.8個(gè)·g-1，其中24 a的孢子密度最高，與15 a差異性顯著。寧夏枸杞在5 a時(shí)總侵染率最高，但樹齡在24 a時(shí)孢子密度最大。

表4 不同種植年限寧夏枸杞菌根侵染率和孢子密度

注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同行不同小寫字母表示Duncan檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。表8同。

2.3 AM真菌與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

菌根侵染率與土壤養(yǎng)分間存在一定的相關(guān)性。由表5可知，叢枝侵染率、菌絲侵染率、孢子侵染率與土壤養(yǎng)分無顯著相關(guān)性，泡囊侵染率(V%)與銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)，孢子密度(SD)與銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)。

表5 AM真菌與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

注：表中數(shù)值表示兩兩之間的Person相關(guān)性；正值表示正相關(guān)，負(fù)值表示負(fù)相關(guān)；**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)。表7同。

2.4 AM真菌的群落結(jié)構(gòu)分析

如圖1所示，4個(gè)樣地寧夏枸杞土壤中AM真菌條帶亮度及組成不一樣。AM真菌G10和G11只在5年生寧夏枸杞中豐度最高，AM真菌G1只存在于24年生寧夏枸杞中，AM真菌G7只存在于10年生和24年生寧夏枸杞中。根據(jù)DGGE圖譜計(jì)算寧夏枸杞根際根中AM真菌群落的香農(nóng)指數(shù)(H′)、豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(Eh)和辛普森指數(shù)(D)，見表6。不同樹齡寧夏枸杞根際根中AM真菌香農(nóng)指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(Eh)不同，5年生條帶數(shù)最多，為11條，香農(nóng)指數(shù)(H′)最高，24年生香農(nóng)指數(shù)(H′)和均勻度指數(shù)(Eh)最低。

由表6可知，不同種植年限寧夏枸杞根際土中AM真菌的香農(nóng)指數(shù)和均勻度指數(shù)存在顯著差異，辛普森指數(shù)無明顯差異，隨著年齡的增長，香農(nóng)指數(shù)逐漸減小，均勻度指數(shù)呈現(xiàn)一定程度的下降，辛普森指數(shù)變化不明顯。5、10 a和24 a寧夏枸杞根際AM真菌差異顯著，說明隨著年齡增長，AM真菌的多樣性減小。

土壤因子和AM真菌群落多樣性指數(shù)成顯著相關(guān)關(guān)系(表7)。AM真菌物種豐度與速效鉀和硝態(tài)氮呈正顯著相關(guān)關(guān)系，與速效磷呈正相關(guān)，均勻度指數(shù)與土壤pH呈正相關(guān)，這些土壤因子是土壤肥力的關(guān)鍵因素，說明AM真菌物種豐度受土壤肥力的影響。物種豐度與土壤pH顯著負(fù)相關(guān)，均勻度指數(shù)與速效磷和銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)，說明鹽脅迫對AM真菌多樣性有不利影響，降低AM真菌多樣性。

圖1 不同種植年限寧夏枸杞根際土AM真菌的DGGE圖譜

參數(shù)種植年限/a5101524香農(nóng)指數(shù)H'2.53±0.28a2.19±0.07b2.11±0.13b 2.01±0.18c均勻度指數(shù)Eh0.98±0.02a0.96±0.02a 0.91±0.01b0.91±0.01b辛普森指數(shù)D0.12±0.01a0.10±0.02a0.12±0.01a0.11±0.02a

表7 土壤因子與AM真菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，條帶G4、G5、G7及G9均存在4個(gè)樣地寧夏枸杞根際土中，且亮度較亮，說明這些細(xì)菌豐度較高。根據(jù)DGGE圖譜計(jì)算寧夏枸杞根中細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)(H′)、豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(Eh)和辛普森指數(shù)(D)，見表8。不同樹齡寧夏枸杞根際根中細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)(H′)、均勻度指數(shù)(Eh)和辛普森指數(shù)(D)均不同。5年生條帶數(shù)最多，為31條，說明5年生寧夏枸杞根際根中細(xì)菌種類最多，5年生香農(nóng)指數(shù)(H′)最高，但均勻度指數(shù)(Eh)和辛普森指數(shù)(D)最低。15 a條帶最少，為23條，辛普森指數(shù)(D)最高。

圖2 不同種植年限寧夏枸杞根際細(xì)菌的DGGE圖譜

不同種植年限寧夏枸杞根際細(xì)菌多樣性指數(shù)存在差異，由表8可知，隨著年齡的增加，香農(nóng)指數(shù)逐漸減小，10、15 a和24 a寧夏枸杞根際細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)差異顯著。均勻度指數(shù)隨著年齡的增長呈下降趨勢，15 a和24 a寧夏枸杞根際細(xì)菌均勻度指數(shù)差異顯著，且在24 a達(dá)到最低。辛普森指數(shù)無明顯差異。

2.6 優(yōu)勢AM真菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

對DGGE膠上的條帶進(jìn)行回收、克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析，分別鑒定出這4個(gè)樣地寧夏枸杞根際優(yōu)勢AM真菌，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖3。4個(gè)樣地中，不同種植年限寧夏枸杞根際AM真菌存在差異，種植5 a寧夏枸杞根際AM真菌主要來自管柄囊霉屬(Funneliformis)、球囊霉屬(Glomus)和無梗囊霉屬(Acaulospora)，10 a寧夏枸杞根際AM真菌主要來自球囊霉屬(Glomus)、多孢囊霉屬(Diversispora)和管柄囊霉屬(Funneliformis)，15 a寧夏枸杞根際AM真菌主要來自球囊霉屬(Glomus)，24 a寧夏枸杞根際AM真菌主要來自無梗囊霉屬(Acaulospora)和多孢囊霉屬(Diversispora)，其中，管柄囊霉屬(Funneliformis)僅出現(xiàn)在種植5 a和10 a寧夏枸杞根際土當(dāng)中，多孢囊霉屬(Diversispora)僅出現(xiàn)在種植10 a和24 a寧夏枸杞根際土當(dāng)中。同時(shí)在種植5 a寧夏枸杞根際土中還發(fā)現(xiàn)了被孢霉屬(Mortierella)的非AM真菌。在鑒定的12個(gè)條帶中，大部分序列與球囊霉科(Glomeraceae)不可培養(yǎng)球囊霉屬(unculturedGlomus)的序列相似。AM真菌DGGE圖譜中較亮的條帶G4、G5、G6和G9均為球囊霉科(Glomeraceae)真菌。

2.7 優(yōu)勢細(xì)菌的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

對DGGE膠上條帶進(jìn)行回收、克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析，分別鑒定出這4個(gè)樣地寧夏枸杞根際根中優(yōu)勢細(xì)菌種屬，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖4。種植5 a和10 a寧夏枸杞根際細(xì)菌差異不明顯，主要來自假單胞菌屬(Pseudomonas)和紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus)，同時(shí)還有鏈霉菌屬(Streptomyces)和分支桿菌屬(Mycobacterium)，種植15 a寧夏枸杞根際細(xì)菌主要是不可培養(yǎng)細(xì)菌(uncultured bacteria)。種植24 a主要是藤黃單孢菌(Luteimonassp.)和β-變形菌。

表8 不同種植年限寧夏枸杞根際細(xì)菌的多樣性指數(shù)

圖3 寧夏枸杞根際AM真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 寧夏枸杞根際細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

3.1 長期人工種植寧夏枸杞根際微生物群落變化

本試驗(yàn)測序結(jié)果表明，隨著種植年限的增長，寧夏枸杞根際土壤的微生物多樣性呈一定程度的下降趨勢，寧夏枸杞根際AM真菌的香農(nóng)指數(shù)在種植5 a時(shí)最高，條帶數(shù)最多，為11條，在種植10 a時(shí)顯著降低(與種植5 a枸杞相比)，在種植24 a時(shí)達(dá)到最低。根際細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)在種植5 a時(shí)最高，條帶數(shù)最多，為31條，說明5 a時(shí)寧夏枸杞根際根中細(xì)菌種類最多，在種植15 a時(shí)顯著降低(與種植10 a相比)，這說明寧夏枸杞根際土壤微生物群落多樣性受種植年限的影響更大。余旋[23]等通過對不同林齡的沙棘人工林研究發(fā)現(xiàn)，林齡對土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分特性有顯著影響。

本研究結(jié)果表明，AM真菌主要來自球囊霉科(Glomeraceae)、多孢囊霉科(Diversisporaceae)和無梗囊霉科(Acaulosporaceae)，其中球囊霉科(Glomeraceae)是該樣地的優(yōu)勢科，這與Liu[10]等研究結(jié)果一致。不同種植年限寧夏枸杞根際微生物群落存在差異，根內(nèi)球囊霉(Glomus)是主要優(yōu)勢菌，但不同年份變化，根內(nèi)球囊霉(Glomus)的豐度存在差異。根內(nèi)球囊霉(Glomus)在種植5 a的枸杞中豐度最高，多孢囊霉屬(Diversispora)只存在于10 a和24 a寧夏枸杞中，管柄囊霉屬(Funneliformis)主要存在于種植5 a和10 a的寧夏枸杞中。細(xì)菌主要來自擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，其中變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌為優(yōu)勢菌，這與納小凡[24]等的研究一致。細(xì)菌根際群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞根際富集著大量變形細(xì)菌。通過對擬南芥[25]和玉米[26]根際研究發(fā)現(xiàn)變形細(xì)菌的富集分布，表明變形細(xì)菌具備適應(yīng)多種植物根際微環(huán)境的特征。長期人工種植寧夏枸杞根際微生物群落的變化可能與長期施肥和根際分泌物積累有關(guān)[27-29]。

3.2 土壤因子與AM真菌侵染率和多樣性指數(shù)的關(guān)系

AM真菌的生長發(fā)育及生理功能受到土壤環(huán)境因子直接或間接的影響。土壤因子在影響AM真菌侵染率的過程中，彼此之間存在相互制約或相互促進(jìn)的復(fù)雜關(guān)系[30]。本研究中銨態(tài)氮與孢子密度呈正相關(guān)，與AM真菌侵染率呈負(fù)相關(guān)。這與謝靖[31]等研究結(jié)果不一致，可能是由不同宿主植物對土壤氮的需求差異所導(dǎo)致。本研究中，寧夏枸杞在樹齡5 a時(shí)AM真菌侵染率最高，但在樹齡24 a時(shí)孢子密度最高，說明AM真菌侵染率與孢子密度并無嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系，這可能與植物的發(fā)育狀況、根際微環(huán)境以及真菌產(chǎn)孢特性等因素有關(guān)[32]，與劉振坤[33]等研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，AM真菌物種豐度與速效鉀和硝態(tài)氮呈正顯著相關(guān)關(guān)系，與速效磷呈正相關(guān)，這與Liu[10]的研究一致。均勻度指數(shù)與土壤pH呈正相關(guān)，這些土壤因子是土壤肥力的關(guān)鍵因素，說明AM真菌物種豐度受土壤肥力的影響。這可能是由于高肥力土壤中的植物長勢更好，因此能接納更多的AM真菌。物種豐度與土壤pH顯著負(fù)相關(guān)，均勻度指數(shù)與速效磷和銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明鹽脅迫對AM真菌多樣性有不利影響，降低AM真菌多樣性。由此可知，AM真菌群落結(jié)構(gòu)受土壤因子的影響。

施肥是寧夏枸杞苗圃地種植中最為常見的管理措施之一，而其中以磷肥和氮肥對AM真菌的影響較大。土壤速效磷含量過高往往會抑制AM真菌的生長、發(fā)育和功能[34-35]。H.Kahiluoto[36]等研究發(fā)現(xiàn)，植物根系的AM真菌侵染率和土壤中的孢子密度隨磷肥施用量的增加而減少。Jensen and Jakobsen[37]研究了丹麥5個(gè)不同施磷水平的農(nóng)田中小麥和大麥的AM真菌侵染率，發(fā)現(xiàn)低磷農(nóng)田中AM真菌根系侵染率最高，施磷顯著降低了AM真菌的侵染率和孢子密度。本研究發(fā)現(xiàn)，速效磷含量隨著種植年限增加呈上升趨勢，并在第10年達(dá)到最高，但速效磷與AM真菌孢子密度無顯著相關(guān)性，這可能與長期施加磷肥及植物對磷的利用率較低有關(guān)[38-39]。