王小麗，方偉超，劉云鶴，趙 佩，毛冬敏，王新衛(wèi)

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

桃(Prunuspersica)原產(chǎn)我國，屬薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)桃亞屬(Amygdalus)，是我國第3大落葉果樹[1]，其面積和產(chǎn)量均居世界首位[2]。在較冷的北方地區(qū)，低溫成為制約桃樹安全越冬、豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因子，所以，研究桃品種抗寒性對(duì)于栽培地選擇、引種具有一定指導(dǎo)意義。有關(guān)桃抗寒性方面的研究，大多是在田間自然條件下展開。作者通常對(duì)冬季極端低溫下受凍害桃樹的不同器官展開分析，如花芽、葉芽、枝條、樹干等，同時(shí)有針對(duì)性的提出一些防凍及補(bǔ)救措施[3-6,19-21]。因極端低溫發(fā)生具有局域性以及某一區(qū)域栽培品種種類通常有限，造成大多數(shù)桃品種抗寒性無法評(píng)估，直接導(dǎo)致引種不當(dāng)而引發(fā)的凍害問題，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。所以，模擬人工低溫條件研究桃抗寒性顯得很有必要。目前，一些研究人員在人工模擬低溫條件下，對(duì)一些桃品種抗寒性做了相關(guān)評(píng)價(jià)，如王召元[9]等在0～-40℃人工模擬低溫梯度下，對(duì)9份桃品種的抗寒性做了評(píng)價(jià)，表明LT50分布在-20～-25℃之間，與枝條木質(zhì)部比率及木質(zhì)部厚度/皮層厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與皮層比率呈正相關(guān)，試驗(yàn)最終得出‘木質(zhì)部比率和皮層比率’可作為鑒定桃抗寒性的有效指標(biāo)。張海旺[8]等在4～-70℃低溫梯度下，以2份桃品種為材料，研究電阻抗與抗寒性之間的關(guān)系，表明胞外電阻率可作為枝條抗寒性的最佳指標(biāo)。楊春祥[10]等在0～-9℃低溫梯度下對(duì)4份油桃桃抗寒性展開研究，表明蕾期抗寒性大于盛花期，盛花期大于幼果期。劉天明[7]等在-16～-30℃低溫梯度下，對(duì)82份桃品種抗寒性展開研究，表明桃一年生枝條抗寒性最高(-19～-27℃)，葉芽次之(-18.5～-26.1℃)，花芽最小(-17～-24℃)；枝條不同結(jié)構(gòu)的抗寒順序依次為韌皮部>木質(zhì)部>形成層>髓；作者認(rèn)為-23℃可作為桃能否安全越冬的臨界溫度。這些研究均在人工模擬低溫梯度下研究了桃樹的抗寒特性，并明確了不同組織器官的抗寒差異性，但因受資源種類限制，研究結(jié)果缺乏系統(tǒng)性。本文以來源于我國58份桃種質(zhì)為試驗(yàn)材料，測(cè)定不同低溫處理下細(xì)胞電解質(zhì)外滲率，同時(shí)結(jié)合Logistic方程，求得半致死溫度(LT50)，確定各種質(zhì)的抗寒水平，以期發(fā)掘優(yōu)異抗寒種質(zhì)，為抗寒性品種選育及引種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用58份材料均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家果樹種質(zhì)鄭州桃圃(表1)。采樣樹體均為多年生植株，露地栽培，管理水平一致，生長勢(shì)良好。每份種質(zhì)選取生長勢(shì)相近的1年生長度、粗細(xì)一致的36根休眠枝條。

1.2 處理

將休眠枝條剪去兩端，留約30 cm，兩端封蠟，先后用自來水、蒸餾水沖洗干凈。每份種質(zhì)取枝條約36根，分成12組(對(duì)應(yīng)12個(gè)溫度梯度)，置于超低溫冰箱的4℃處理溫度中，12 h之后，取出第1批枝條，以5℃/h的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度后，在此溫度中放置12 h。同樣的方法處理第2批枝條、第3批枝條，直至最后一批枝條。每一批處理過的枝條在0℃放置8 h后可用于測(cè)定電解質(zhì)外滲率。12個(gè)溫度梯度依次為4℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃、-15℃、-18℃、-21℃、-24℃、-27℃、-30℃、-33℃。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

將處理后的枝條剪成2 cm長的小段(避開芽眼)，混合均勻，用無離子水沖洗3遍，用電子天平稱1 g枝條放入75 mL試管中，加入40 mL無離子水，每份種質(zhì)重復(fù)3次。真空滲入30 min后，室溫下靜置12 h，用電導(dǎo)儀測(cè)定煮前浸提液的電導(dǎo)值，然后再將試管置于沸水中，封口，煮沸20 min后開封，在室溫下放置4 h，再次測(cè)定電導(dǎo)值，同時(shí)測(cè)無離子水的電導(dǎo)率，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率，之后利用以下公式測(cè)定細(xì)胞傷害率(即電解質(zhì)外滲率)[11]。

細(xì)胞傷害率=(樣品低溫處理后電導(dǎo)率-蒸餾水的電導(dǎo)率)/(樣品煮后電導(dǎo)率-蒸餾水的電導(dǎo)率)×100%

轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率y′=ln[(k-y)/y]

將Logistic方程y=k/(1+ae-bt)轉(zhuǎn)化為ln[(k-y)/y]=lna-bt，變成轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率y′與處理溫度t的直線方程，通過直線相關(guān)求出系數(shù)a、b值，再由t=lna/b求出拐點(diǎn)溫度，即半致死溫度LT50。y為細(xì)胞傷害率，t代表冷凍溫度，k為細(xì)胞傷害率的飽和容量為100[12]。

數(shù)據(jù)處理使用Excel2013、Spss19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃種質(zhì)不同低溫的電解質(zhì)外滲率變化

圖1表明，處理溫度從4℃降至-3℃，大多數(shù)種質(zhì)的電解質(zhì)外滲率呈下降趨勢(shì)，可能是低溫初期的自我保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用。這時(shí)細(xì)胞剛受到低溫脅迫，質(zhì)膜功能正常，通過減少物質(zhì)外運(yùn)率，以降低胞質(zhì)溶液的結(jié)冰溫度，進(jìn)而適應(yīng)低溫脅迫。處理溫度從-3℃降至-21℃，大多數(shù)種質(zhì)電解質(zhì)外滲率變化較平穩(wěn)，僅有6.11%的上升幅度，可能是這個(gè)溫度段內(nèi)，質(zhì)膜雖受到不同程度的損傷，但損傷能被及時(shí)修復(fù)，即低溫?fù)p傷與修復(fù)處于平衡狀態(tài)。處理溫度從-21℃降至-33℃，所有測(cè)試種質(zhì)外滲率呈上升趨勢(shì)，且上升幅度較大，達(dá)39.22%，可能是這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p傷，無法及時(shí)修復(fù)，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲率大增，從而出現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)。

表1 試驗(yàn)種質(zhì)材料

2.2 桃種質(zhì)半致死溫度比較

應(yīng)用Logistic擬合方程對(duì)處理溫度下的細(xì)胞傷害率進(jìn)行回歸分析，計(jì)算供試種質(zhì)半致死溫度。結(jié)果表明，處理溫度與電解質(zhì)滲出率之間呈極顯著負(fù)相關(guān)的種質(zhì)有46個(gè)，相關(guān)系數(shù)在0.710～0.924，呈顯著負(fù)相關(guān)的有12個(gè)，相關(guān)系數(shù)在0.615～0.708，說明半致死溫度與Logistic方程相關(guān)性高，數(shù)據(jù)可靠。58份種質(zhì)半致死溫度變化范圍在-17.31～-44.13℃，其中-17～-25℃的占6.9%，-25～-30℃的占22.4%，-30℃至-35℃的占60.3%，-35～-45℃的占10.3%，說明大多數(shù)桃種質(zhì)半致死溫度集中在-25～-35℃，該溫度范圍內(nèi)，大多數(shù)桃種質(zhì)質(zhì)膜開始受到嚴(yán)重?fù)p傷，并開始進(jìn)入半致死狀態(tài)，如果溫度繼續(xù)下降，質(zhì)膜所受損傷將不可恢復(fù)，具體數(shù)值見表2。

2.3 桃種質(zhì)抗寒性聚類分析

采用歐氏距離及半致死溫度對(duì)生育地分布在全國各地的桃種質(zhì)進(jìn)行類平均法(UPGMA)聚類分析(圖2)。結(jié)果表明，在歐式距離為6.87的情況下，58份桃種質(zhì)被聚為3類：2010西藏17、2010西藏28、2010西藏32、2010西藏54聚為一類，均為來源于青藏高原的地方品種，抗寒性最弱。夏至早紅、江村4號(hào)、丁家壩青皮桃聚為一類，其中前者為育成品種，后兩者均為來源于西北高旱地區(qū)的地方品種，三者抗寒性最強(qiáng)；其余51份被聚為一類，半致死溫度在-27.61～-35.74℃，這些種質(zhì)在4.58的歐式距離下，又被分為2類。其中一類半致死溫度在-27.61～-30.91℃，地方品種10個(gè)，占所有測(cè)試地方品種的35.7%，選育品種及品系9個(gè)，占所有測(cè)試選育品種的30%。另一類半致死溫度在-31.34～-35.74℃，地方品種12個(gè)，占所有測(cè)試地方品種的42.8%，選育品種20個(gè)，占所有測(cè)試選育品種的66.7%。以上表明，所有測(cè)試的地方品種，抗寒性強(qiáng)弱分布較均勻，可能和青藏高原東南部、西北地區(qū)的復(fù)雜地理特征、氣候特征有關(guān)。所有測(cè)試的選育品種及品系，抗寒性強(qiáng)的所占比例居多，可能和育種工作者對(duì)抗寒性狀的重視程度有關(guān)。

圖1 處理溫度與細(xì)胞傷害率的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

果樹受到低溫脅迫時(shí)，質(zhì)膜透性會(huì)增加，電解質(zhì)會(huì)出現(xiàn)不同程度的外滲[12]。電解質(zhì)常以電解質(zhì)外滲率的方式測(cè)定，通常電解質(zhì)外滲率越高，質(zhì)膜受損傷程度越嚴(yán)重，反之亦然[13,26]。電解質(zhì)外滲率變化常出現(xiàn)在枝條形態(tài)變化之前，因此可作為果樹受凍害的生理指標(biāo)。多數(shù)研究表明，在一定的低溫范圍內(nèi)，電解質(zhì)外滲率變化呈‘S’型曲線，即先緩慢增加，然后激增，最后又緩慢增加。開始激增的溫度因果樹類型不同而存在差異，如梨樹開始激增溫度為-25℃[17]，蘋果為-30℃[11]，野生柑橘為-10℃左右[22]，葡萄為-20℃[25]，火龍果為4℃[15]。本試驗(yàn)中，處理溫度從4℃降至-21℃時(shí)，大多數(shù)種質(zhì)電解質(zhì)外滲率變化趨勢(shì)平緩，-21℃降至-33℃時(shí)，電解質(zhì)外滲率變化趨勢(shì)上升，且上升幅度較大(39.22%)，表明開始激增的溫度為-21℃，該溫度之前的一段低溫范圍內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)膜的低溫?fù)p傷與修復(fù)處于動(dòng)態(tài)平衡之中，而該溫度之后的一段低溫范圍內(nèi)，低溫?fù)p傷大于修復(fù)，質(zhì)膜損傷程度逐漸加重，所以，該溫度可作為桃抗寒性評(píng)價(jià)的臨界溫度，可用于桃樹引種及冬季管理等方面。

已有研究表明，桃樹[7]、梨樹[16-17]、蘋果樹[18]、柑橘[14]、火龍果[15]枝條半致死溫度均能準(zhǔn)確的反映其抗寒性，表現(xiàn)為半致死溫度越低，抗寒性越強(qiáng)。本研究表明，82.7%的參試桃種質(zhì)，其枝條半致死溫度集中在-25～-35℃，該溫度已經(jīng)超出自然栽培的最低氣溫，說明大多數(shù)桃種質(zhì)具有較強(qiáng)的抗寒潛力；10.3%的種質(zhì)，其枝條半致死溫度集中在-35～-45℃，說明這些種質(zhì)抗寒性強(qiáng)，可作為引種對(duì)象，同時(shí)也可作為育種親本，培育抗寒品種。

果樹抗寒性是其長期適應(yīng)低溫環(huán)境而形成的一種特性，具有遺傳潛質(zhì)，同時(shí)受生長環(huán)境影響?？购嚓P(guān)基因的表達(dá)通常具有低溫誘導(dǎo)特性，即在適溫生長時(shí)，這些基因不表達(dá)，只有在受到低溫脅迫時(shí)，才能轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)抗凍蛋白[23-24]?？购嚓P(guān)基因的傳播除了環(huán)境因素外，還受到人為因素影響，尤其是遠(yuǎn)距離傳播時(shí)，人為因素更發(fā)揮著重要作用。這主要是因?yàn)楣麡渚哂猩唐穬r(jià)值，可以用作商品進(jìn)行交換，其種子通過這種途徑便可分布在不同地方。我國幅員遼闊，幾千年前東西之間就形成了絲綢之路，用于商業(yè)之用，南北城市之間已廣泛通商，通往青藏高原有‘茶馬古道’，這些途徑促進(jìn)了商品交流，也對(duì)果樹南北、東西之間流通發(fā)揮了積極作用。于是，原產(chǎn)于高緯度的抗寒種質(zhì)被帶入低緯度，使低緯度地區(qū)出現(xiàn)抗寒種質(zhì)，原產(chǎn)于低緯度的種質(zhì)同樣被帶入高緯度，但因被帶入的地方冬季氣溫低，帶入的種質(zhì)可能出現(xiàn)2種情況：其一，不能適應(yīng)低溫而被淘汰，其二，發(fā)生突變而適應(yīng)當(dāng)?shù)氐蜏丨h(huán)境。所以，在對(duì)果樹種質(zhì)進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)考慮到3個(gè)方面的因素，即遺傳特性、環(huán)境影響與人為因素影響。本研究對(duì)來源于我國高海拔、西北高旱地區(qū)的28份地方桃品種及30份選育桃品種及品系的抗寒性展開評(píng)價(jià)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果以上述3個(gè)因素為依據(jù)進(jìn)行分析。

圖2 基于58份桃種質(zhì)半致死溫度的聚類分析系譜圖

種質(zhì)y=k/(1+ae-bt)LT50/℃擬合度R2種質(zhì)y=k/(1+ae-bt)LT50/℃擬合度R22010西藏17號(hào) y=100/(1+611.18e-0.37t)-17.310.881**滬油004 y=100/(1+4250.69e-0.26t)-32.150.812**2010西藏54號(hào) y=100/(1+5517.08e-0.46t)-18.660.896**瑰玉 y=100/(1+3.99e-0.04t)-32.280.774**2010西藏32號(hào) y=100/(1+1117.32e-0.31t)-23.000.9**瑞光28號(hào) y=100/(1+64.30e-0.13t)-32.330.851**2010西藏28號(hào) y=100/(1+189.90e-0.22t)-24.240.822**錦香 y=100/(1+60098.85e-0.34t)-32.430.773**秋露 y=100/(1+16.59e-0.10t)-27.610.71**臨黃1號(hào) y=100/(1+88.86e-0.14t)-32.770.734**光核桃(阿壩) y=100/(1+79.63e-0.16t)-27.970.71**霞暉8號(hào) y=100/(1+390.81e-0.18t)-32.780.748**中油金銘 y=100/(1+152.44e-0.18t)-280.851**金露 y=100/(1+64.25e-0.13t)-32.830.823**隆盛蟠桃 y=100/(1+419.34e-0.22t)-28.080.65*秦家灣早桃y=100/(1+5237.05e-0.261t)-32.940.724**金霞油蟠桃 y=100/(1+65.97e-0.15t)-28.120.79**滬油002 y=100/(1+2842.70e-0.24t)-32.990.719**葉縣黃肉桃 y=100/(1+563.12e-0.23t)-28.140.639*中農(nóng)金輝y=100/(1+22.47e-0.09t)-33.110.688*春蜜 y=100/(1+486.57e-0.22t)-28.180.881**秦蜜 y=100/(1+2140.05e-0.23t)-33.190.704*吐-2 y=100/(1+445.20e-0.21t)-28.550.645*中油8號(hào) y=100/(1+152.05e-0.15t)-33.430.801**西莊1號(hào) y=100/(1+1086.99e-0.24t)-28.590.753**金塔紅光 y=100/(1+29.94e-0.10t)-33.480.69*墨玉8號(hào)y=100/(1+2353.49e-0.27t)-28.900.924**霞脆 y=100/(1+431.80e-0.18t)-33.50.841**黃艷y=100/(1+5.18e-0.06t)-28.940.866**中蟠桃10號(hào) y=100/(1+19.87e-0.09t)-33.510.916**中油13號(hào)y=100/(1+64.29e-0.14t)-29.480.746**錦園 y=100/(1+304.89e-0.17t)-33.90.795**隆盛大晚桃 y=100/(1+142.21e-0.17t)-29.760.691*江村1號(hào) y=100/(1+199.855e-0.16t)-33.950.847**春艷 y=100/(1+87.91e-0.15t)-30.010.755**隆盛新疆桃 y=100/(1+103.90e-0.14t)-34.220.841**南方金蜜 y=100/(1+42212.43e-0.35t)-30.340.857**瑞蟠21號(hào) y=100/(1+24.85e-0.09t)-34.270.82**塔園粘核桃y=100/(1+213.50e-0.18t)-30.440.885**霞暉6號(hào) y=100/(1+68.02e-0.12t)-34.720.647*曙光 y=100/(1+1206.93e-0.23t)-30.510.867**瑞光33號(hào) y=100/(1+146.58e-0.14t)-34.740.878**中蟠桃11號(hào)y=100/(1+18.47e-0.09t)-30.760.824**月牙紅李光 y=100/(1+1073.77e-0.20t)-34.760.708*丁家壩紅李光 y=100/(1+17.535e-0.09t)-30.910.754**中油12號(hào) y=100/(1+7.14e-0.06t)-34.780.778**下廟1號(hào)y=100/(1+837.39e-0.21t)-31.340.615*滬油018 y=100/(1+13.94e-0.07t)-35.20.797**秋月 y=100/(1+1.15e-0.004t)-31.40.843**春元 y=100/(1+97.80e-0.13t)-35.700.697*南山1號(hào) y=100/(1+17.46e-0.09t)-31.690.775**紅光晚李光桃 y=100/(1+46.58e-0.11t)-35.740.681*龍2-4-6 y=100/(1+89.81e-0.14t)-31.780.717**夏至早紅 y=100/(1+6.19e-0.05t)-38.500.733**中桃紅玉 y=100/(1+141.58e-0.16t)-31.940.874**江村4號(hào) y=100/(1+2.98e-0.03t)-39.430.718**伊犁縣黃肉桃y=100/(1+55.55e-0.13t)-32.090.729**丁家壩青皮桃 y=100/(1+5.41e-0.04t)-44.130.758**

本研究中，來源于青藏高原桃區(qū)的地方品種，抗寒性在所有參試品種中最低。這和青藏高原平均海拔高、氣溫低的環(huán)境特性相悖，作者認(rèn)為可能和當(dāng)?shù)氐木钟蛐孕夂蛴嘘P(guān)。測(cè)試品種的所在地‘林芝’，西、北、東三方向有喜馬拉雅山、念青唐古拉山、橫斷山脈相連接，僅東南方向形成一個(gè)出口，印度洋、太平洋暖流循口而入，形成特殊的亞熱帶氣候，年均氣溫較高，該生長環(huán)境極有可能造就了當(dāng)?shù)靥业胤狡贩N較弱的抗寒性。來源于西北高旱桃區(qū)的地方品種，抗寒性具有一種特殊現(xiàn)象：緯度更高、更靠北的一些品種，抗寒性較緯度較低、更靠南的品種更低，相反，一些緯度相對(duì)較低的品種，其抗寒性表現(xiàn)出極強(qiáng)的特性。這至少說明兩點(diǎn)：第一，更靠北的地區(qū)的冬季最低氣溫，至少在抗寒性較差的品種的半致死溫度范圍之內(nèi)。第二，緯度更高、更靠北的抗寒基因可能流入緯度較低、更靠南的地區(qū)，使該地區(qū)出現(xiàn)抗寒性較強(qiáng)的地方品種。作者認(rèn)為這種流入可能和人為因素有關(guān)，因?yàn)椤z綢之路’在兩千多年前就已經(jīng)形成，而本次測(cè)試的品種都在絲綢沿線或附近，這使得源自于高緯度的抗寒品種，極有可能被商旅帶回到緯度相對(duì)較低的地區(qū)，從而使這些地區(qū)出現(xiàn)抗寒性高的地方品種。所有測(cè)試的選育品種及品系，抗寒性強(qiáng)的占66.8%，表明抗寒基因在多數(shù)選育品種及品系中已有效積累，同時(shí)也說明抗寒性已作為一個(gè)主要性狀被育種工作者所重視。

對(duì)于大多數(shù)測(cè)試品種而言，-21℃可作為細(xì)胞膜開始受損傷的臨界溫度，-21～-30℃，細(xì)胞膜損傷程度加大，超過此范圍，細(xì)胞膜損傷將不會(huì)被修復(fù)。通過抗寒性評(píng)價(jià)，篩選出3個(gè)高抗資源。