賴文珍，王思佳，胡文濤，唐 明，謝賢安

(華南農業(yè)大學 廣東省森林植物種質創(chuàng)新與利用重點實驗室，林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌在自然界分布廣泛，能與80%以上陸生維管束植物形成叢枝菌根，是內生菌根的主要類型[1]。叢枝菌根的形成能夠提高植物生物量[2-3]、改善植物水分代謝[4]、提高植物抗逆能力[5-6]和改良土壤理化性質[7]。Zhang[8]等研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫條件下接種AM真菌和深色有隔內生真菌(dark septate endophytes，DSE)顯著提高枸杞(Lyciumbarbarum)葉片氣導度和光合速率以減輕干旱脅迫的毒害作用，Hu[5]等從分子水平研究了水分脅迫下AM真菌對枸杞響應干旱及低磷壓力的影響。B.H.Ren[9]等通過對重金屬鉻進行追蹤定位，發(fā)現(xiàn)AM真菌外生菌絲吸收并積累重金屬鉻，阻止重金屬鉻向植物地上部分轉移，從而提高宿主植物對重金屬的抗性。AM真菌還能維持植物群落系統(tǒng)結構的多樣性、穩(wěn)定性，加快退化土地的修復，對促進農林牧生產、生態(tài)系統(tǒng)的修復和穩(wěn)定有著極其重要的意義[10]。

在華南地區(qū)，有關菌根的研究多為喬木外生菌根的調查與分布[11-12]，關于林木AM真菌侵染狀況的調查研究較少，涉及的樹種也較少。有研究報道，接種AM真菌于馬鞍羊蹄甲(Bauhiniafaberivar.microphylla)和構樹(Broussonetiapapyrifera)，促進了幼苗生長，提高了根際土壤酶活性，增加植株吸收氮、磷營養(yǎng)[13-15]。葉新峰等[16]研究發(fā)現(xiàn)接種AM真菌使尾葉桉(Eucalyptusurophylla)幼苗明顯增高并隨著時間的推移而不斷增加。王宇濤[17]研究了珠江河岸的深圳和珠海兩處紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的AM真菌群落多樣性，鑒定出6種AM真菌。高秀兵和李增平[18]從海南橡膠樹(Heveabrasiliensis)根際中鑒定出5屬31種AM真菌，其中球囊霉屬(Glomus)是分離頻率最高屬，蜜色無梗囊霉(Acaulosporamellea)是分離頻率最高種。

在華南地區(qū)，鄉(xiāng)土樹種紅花羊蹄甲(Bauhiniablakeana)和杧果(Mangiferaindica)作為常見風景園林植物和行道樹而被廣泛種植，黃梁木(Neolamarckiacadamba)、構樹(B.papyrifera)和尾葉桉(E.urophylla)等速生樹種也在華南地區(qū)廣泛分布。本研究針對以上5種華南主要樹木開展AM真菌侵染狀況調查，并通過其形態(tài)特征及核糖體18SrRNA基因序列分析其AM真菌多樣性，對進一步探究華南地區(qū)主要樹木AM真菌多樣性及其生物學功能多樣性有著十分重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在華南農業(yè)大學校園和苗圃試驗基地(23°9′10″N，113°20′22″E)采集紅花羊蹄甲(B.blakeana)、構樹(B.papyrifera)、尾葉桉(E.urophylla)、杧果(M.indica)和黃梁木(N.cadamba)5種樹木側根及其根際土。每種樹選擇2株樣樹，在樹冠投影范圍內，東西或南北方向對稱采樣，采集土層深度0～30 cm范圍內的根系和根際土樣品約1 kg，封口標記，4℃冰箱保存。根樣用于測定AM真菌侵染率。根際土用于孢子分離、孢子密度統(tǒng)計和AM真菌鑒定。

1.2 AM真菌侵染率測定

將采集的根樣沖洗干凈，采用Koske & Gemma[19]改進的臺盼藍染色法進行染色。在光學顯微鏡下統(tǒng)計AM真菌侵染狀況[20]，參照A.Trouvelot[21]等的方法統(tǒng)計菌根真菌侵染率與侵染強度。

1.3 AM真菌孢子分離與孢子密度測定

采用濕篩-傾注-蔗糖離心法進行AM真菌孢子分離，將孢子收集于直徑9 cm培養(yǎng)皿的濾紙上，用體式顯微鏡統(tǒng)計每克風干土樣中所含AM真菌孢子數(shù)量，測定孢子密度[1]。

1.4 AM真菌孢子形態(tài)學鑒定

將經過濕篩傾析法分離的孢子制片，顯微鏡下觀察孢子聚集方式及在孢子果內的排列方式，孢子的形狀、大小、顏色和表面修飾，孢壁層次及染色反應，孢子內含物，連孢菌絲，輔助細胞(土生泡囊)等特征，根據國際AM真菌保藏中心INVAM相關網站及菌根真菌分類文獻[22]進行鑒定。

1.5 AM真菌的分子鑒定

1.5.1 根系DNA提取與核糖體18SrRNA基因分析 分別挑選各種樹種根系側根，采用植物DNA微量提取試劑盒(美國Omega公司，產品編號：D2485)提取菌根組織基因組DNA。將提取的DNA樣品直接作為擴增模板，采用引物NS1/NS4和AML1/AML2對根系DNA進行巢式PCR擴增[23]。

采用美國OMEGA Bio-Tek公司的膠回收試劑盒(產品編號：D2500)所提供的方法，對PCR產物大小為800 bp左右單一條帶進行切膠回收，回收產物根據擎科(TsingKe)公司pClone007 簡單載體試劑盒(TSV-007S)進行T/A克隆并將其轉化入E.coli DH5α，反應體系為10 μL，ddH2O 5 μL，PCR產物3.5 μL，10×TOPO Mix 1 μL，pClone007 simple vector 0.5 μL。在培養(yǎng)得到轉化子的平板中，對每個單獨樣品挑選5個轉化子送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序。將得到的測序結果在NCBI的Blastn在線工具中進行同源比對分析，根據AM真菌核糖體18SrRNA基因序列，鑒定根系中AM真菌的種類。

1.5.2 AM真菌孢子的分子鑒定 對1.3中收集的AM真菌孢子，采用單孢PCR的方法進行分子鑒定[24-25]。將AM真菌孢子采用2%的氯胺T表面消毒15 min，0.02%的鏈霉素和0.01%的慶大霉素混合溶液表面消毒10 min，在體式顯微鏡下，用潔凈解剖針將孢子移入無菌PCR管內壓碎，并用移液器注射1 μL的無菌甘油。含有孢子DNA的內含物直接作擴增模板，進行巢式PCR擴增、膠回收及T/A克隆轉化培養(yǎng)后，每個樣品挑選2個轉化子進行測序，將測序結果在NCBI中的Blastn進行比對。結合形態(tài)學特征，確定不同樹木根際土中AM真菌種類。

1.5.3 AM真菌進化樹的構建 將獲得AM真菌序列在NCBI中的Blastn進行同源比對，選擇并下載比對結果中相似度最高的序列作為參考序列，使用MEGA 5.1軟件進行多重序列比對，建立Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹[25]。

2 結果與分析

2.1 AM真菌的侵染狀況及孢子密度

2.1.1 AM真菌的侵染狀況 5種林木根系中均存在AM真菌侵染，并能觀察到菌絲、叢枝與泡囊這些典型的AM結構(圖1)，但5種樹木的叢枝結構類型不同，紅花羊蹄甲和尾葉桉叢枝結構中形成大量根內菌絲，在皮層及內皮層細胞內不斷二叉分支形成典型的叢枝，為疆南星型(arum-type)；杧果、構樹和黃梁木叢枝結構中菌絲在皮層細胞內無規(guī)則卷曲、纏繞，形成典型的菌絲圈，叢枝從菌絲圈上產生，為重樓型(paris-type)(表1)。

表1 華南主要樹木根系中AM真菌侵染狀況

注：“+”表示泡囊數(shù)量為<10%；“++”表示泡囊數(shù)量10%～50%；“+++”表示泡囊數(shù)量為50%～90%；“++++”表示泡囊數(shù)量>90%。

各種林木根系的AM真菌侵染狀況不同(表1)。紅花羊蹄甲的AM真菌侵染率最高，達到92.00%，其次是杧果，為88.33%，構樹的AM真菌侵染率處于中等水平(63.67%)，黃梁木和尾葉桉的AM真菌侵染率為49.67%和48.67%。此外，紅花羊蹄甲和杧果的AM真菌侵染強度分別為45.65%和44.57%，叢枝豐度分別為25.23%和28.33%，均高于另外3種樣樹；構樹和尾葉桉的AM真菌侵染強度為12.29%和11.03%，叢枝豐度為3.86%和2.61%；而黃梁木的AM真菌侵染強度最低，為5.63%，叢枝豐度為2.65%；從泡囊數(shù)量的指標上看，紅花羊蹄甲和杧果根系產生的泡囊相對較多，構樹和尾葉桉相對中等，黃梁木產生的泡囊少。

2.1.2 AM真菌的孢子密度測定 5種宿主林木的根際土中，紅花羊蹄甲和杧果根際土中的孢子密度較高，分別達到了99～119個/g和97～133個/g，構樹和黃梁木根際土中的孢子密度偏低，分別為9～17個/g和17～43個/g，尾葉桉的孢子密度最低，只有2～4個/g(表1)。

2.2 AM真菌的形態(tài)學鑒定和樹種分布

2.2.1 AM真菌形態(tài)學分類 根據AM真菌孢子的顏色、大小、形狀、孢子壁的壁紋及其連孢菌絲等形態(tài)特征，鑒定出5屬8種AM真菌(圖2)，包括無梗囊霉屬(Acaulospora)的細齒無梗囊霉A.denticulata(圖2-A)、淺窩無梗囊霉A.lacunosa(圖2-B)和刺無梗囊霉A.spinosa(圖2-C)，近明球囊霉屬(Claroideoglomus)的近明球囊霉C.claroideum(圖2-D)和幼套近明球囊霉C.etunicatum(圖2-E)，斗管囊霉屬(Funneliformis)的摩西斗管囊霉F.mosseae(圖2-F)，根孢囊霉屬(Rhizophagus)的根內根孢囊霉R.intraradices(圖2-G)，隔球囊霉屬(Septoglomus)的縮隔球囊霉S.constrictum(圖2，H-I)。

注:A-C，紅花羊蹄甲；D-E，杧果；F-G，構樹；H-I，黃梁木；J-K尾葉桉。eh：根外菌絲；ih：根內菌絲；a：叢枝；s：孢子；v：泡囊；h：附著胞；c：根內菌絲卷曲。D、I、K中的標尺長度為20 μm，其余標尺長度為100 μm。

圖1華南主要樹木根系中叢枝菌根結構

Fig.1 Arbuscular mycorrhizas in the roots of the main trees in Southern China

注:C、E、F、G中的標尺長度為20 μm，A、B、D、H、I中的標尺長度為50 μm。

2.2.2 AM真菌的樹種分布 同種AM真菌可以在不同樹種的根際分布，如刺無梗囊霉分布在尾葉桉和杧果根際，細齒無梗囊霉分布在黃梁木和杧果根際，摩西斗管囊霉分布在黃梁木和構樹根際，根內根孢囊霉分布在杧果和紅花羊蹄甲根際，縮隔球囊霉分布在紅花羊蹄甲和尾葉桉根際(表2)。而淺窩無梗囊霉、近明球囊霉和幼套近明球囊霉均只分布在1種樹根際，專一性相對較強。

同種樹種根際存在多種AM真菌分布，如紅花羊蹄甲、杧果和尾葉桉根際均有3種AM真菌分布，紅花羊蹄甲根際存在3個屬的AM真菌(近明球囊霉屬、根孢囊霉屬和隔球囊霉屬的近明球囊霉、根內根孢囊霉和縮隔球囊霉)；杧果根際為2個屬的AM真菌(無梗囊霉屬中的刺無梗囊霉、細齒無梗囊霉和根孢囊霉屬中的根內根孢囊霉)；尾葉桉根際的3種AM真菌為2個屬(無根囊霉屬中的淺窩無梗囊霉、光壁無梗囊霉和隔球囊霉屬中的縮隔球囊霉)；構樹和黃梁木根際均有2種AM真菌分布，構樹根際為近明球囊霉屬和斗管囊霉屬中的幼套近明球囊霉和摩西斗管囊霉，黃梁木根際為無梗囊霉屬和斗管囊霉屬的細齒無梗囊霉和摩西斗管囊霉(表2)。說明不同樹種和不同真菌之間存在一定的選擇性。

表2 AM真菌在不同宿主林木根際中的分布

2.3 AM真菌的分子生物學鑒定

2.3.1 根系DNA提取物與AM真菌孢子的核糖體18SrRNA基因分析 根系DNA提取物經過巢式PCR擴增，對第2輪PCR產物用1%瓊脂凝膠電泳檢測，各樹種均有條帶且條帶均在800 bp左右(圖3)，由此可見，在5個樹種的根系中可能存在AM真菌。

對第2輪PCR產物T/A克隆后的測序結果在NCBI中的Blastn進行比對(表3)，結果表明紅花羊蹄甲、杧果及尾葉桉的根系中均存在較多種類的內生真菌，其中在紅花羊蹄甲根樣的測序結果比對中發(fā)現(xiàn)了AM真菌硬囊霉(Sclerocystissp.)，而在杧果根樣的測序結果比對中發(fā)現(xiàn)根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)，且在多個克隆樣本中均被分離出。

由上述孢子形態(tài)學特征以及根系DNA的PCR產物測定得知5種樹木根際土壤中均分布有AM真菌，并且每種樹根際種均有多種AM真菌分布。對AM真菌的孢子采用巢式PCR進行分子鑒定，其中得到的第2輪PCR擴增產物長度在800 bp左右(圖4)。

圖3 根系DNA的PCR產物1%瓊脂凝膠電泳

樣品號AM真菌宿主樹木3HAO-5Sclerocystis(硬囊霉屬)紅花羊蹄甲4HAO-1Rhizophagus intraradices(根內根孢囊霉)杧果4HAO-2Rhizophagus intraradices(根內根孢囊霉)杧果

注:M1.DL2000 marker；N1-N4.黃梁木；B1-B3.紅花羊蹄甲；G1-G4.構樹；E1、E2.尾葉桉；Mang1-8.杧果。

2.3.2 AM真菌的分子生物學分類 基于根際土AM真菌孢子特征和菌根18SrDNA基因序列，運用Blast工具進行比對，并從NCBI下載GenBank數(shù)據庫內已知同源序列，用軟件MEGA(Version 5.1)進行對比分析，以模式AM真菌RhizophagusirregularisDAOM 197198作為對照，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結果顯示，在不同的樹木根際分布的AM真菌(●標記)有5個屬，分別為無梗囊霉屬(Acaulospora)，球囊霉屬(Glomus)，斗管囊霉屬(Funneliformis)，根孢囊霉屬(Rhizophagus)和硬囊霉屬(Sclerocystis)。其中，根據Blast結果和系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠鑒定出無梗囊霉屬2種，分別是淺窩無梗囊霉(A.lacunosa)、刺無梗囊霉(A.spinosa)；斗管囊霉屬1種，為摩西斗管囊霉(F.mosseae)；根內根孢囊霉屬1種，為根內根孢囊霉(R.intraradices)，其他未能鑒定到種的球囊霉屬(Glomus)3種Glomusspp.，硬囊霉屬(Sclerocystis)1種Sclerocystissp.。球囊霉屬分布在紅花羊蹄甲、杧果、構樹根際，鑒定的AM真菌種類有3種，而摩西斗管囊霉(F.mosseae)在構樹、黃梁木的根際土中均有分布(表4)，比其他的種類分布廣泛。顯然，在華南地區(qū)5種主要樹木根際AM真菌的優(yōu)勢屬為球囊霉屬，摩西斗管囊霉為優(yōu)勢種。

注:自展1 000次，顯示>50%的自展值。

不同樹種根際分離的AM真菌種類具有普遍性和特異性，如球囊霉屬的AM真菌廣泛分布在紅花羊蹄甲、杧果、構樹根際中，刺無梗囊霉分布在杧果和尾葉桉根際，摩西斗管囊霉分布在構樹和黃梁木根際。而淺窩無梗囊霉和硬囊霉屬只分布在1種樹根際，專一性相對較強。同種樹種存在多種AM真菌，如杧果根際分布有3個屬，其中有無梗囊霉屬中的刺無梗囊霉、球囊霉屬和根孢囊霉屬中的根內根孢囊霉3種AM真菌，尾葉桉根際有淺窩無梗囊霉和刺無梗囊霉2種AM真菌分布，紅花羊蹄甲根際有2個屬球囊霉屬和硬囊霉屬2種AM真菌分布，構樹根際有球囊霉屬和斗管囊霉屬中的摩西斗管囊霉2種AM真菌分布，黃梁木根際僅有斗管囊霉屬中的摩西斗管囊霉。

表4 不同樹種根際分離的AM真菌種類

3 結論與討論

3.1 不同樹種AM真菌的侵染狀況及AM真菌多樣性

本研究所調查的5種樹中均能被AM真菌侵染，所形成的叢枝類型也各有差異，其中Paris-type較為常見，這與宿主植物的根系皮層細胞壁結構和細胞間間隙有著密切的聯(lián)系[26]。杧果和紅花羊蹄甲根系的AM真菌侵染率、侵染強度、叢枝豐度及根際的孢子密度等指標都遠高于黃梁木和尾葉桉。這與AM真菌與植物相互選擇有關[1]。研究表明杧果根系中較高的可溶性糖、植物生長素及一些分泌物，對AM真菌孢子的萌發(fā)和生長繁殖有促進作用，從而形成較為良好的共生體系[27]；而紅花羊蹄甲是豆科植物，有研究指出豆科植物與AM真菌和根瘤菌之間能夠形成良好的共生關系，這有可能是在共生體建立過程中存在的信號轉導機制[28]；而尾葉桉除了能與AM真菌形成共生體之外，還能與外生菌根真菌形成外生菌根[11-12]。

一直以來，球囊霉屬AM真菌在眾多的抗逆性研究中都表明其對受到人為干擾的環(huán)境具有更好的適應能力，相比其他種類的AM真菌，球囊霉屬AM真菌具有較高的孢子萌發(fā)速率，從而可以迅速從干擾中恢復[29]，所以球囊霉屬一直處于廣泛分布的地位?，F(xiàn)分類系統(tǒng)中球囊霉屬68種中66種因系統(tǒng)發(fā)育位置不明確被定義為廣義種[22]。本研究結果表明，在華南主要樹木根際土中分布球囊霉屬為優(yōu)勢屬，且較為常見。雖未鑒定到種，但在杧果、紅花羊蹄甲、構樹的根際土中，均有球囊霉屬的AM真菌分布。摩西斗管囊霉為分布優(yōu)勢種，其在北方、東南沿岸地區(qū)及華南地區(qū)均較為普遍，其適應性范圍較為廣泛，屬于廣幅生態(tài)型[30]。此外，在華南地區(qū)發(fā)現(xiàn)無梗囊霉屬和硬囊霉屬，較北方地區(qū)常見，其中硬囊霉屬是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)較常見的屬，具有地區(qū)特異性[31]，增加了華南地區(qū)AM真菌分布的多樣性。

3.2 AM真菌在宿主林木根際分布的普遍性和特異性

AM真菌是生活在植物根內的專性共生真菌，宿主植物對其多樣性具有一定的影響。Liu & Wang[32]研究表明，不同種類的植物，由于其根系的形態(tài)、分泌物及生理生態(tài)代謝存在差異，從而影響AM真菌對植物的侵染和識別，甚至影響AM真菌的生長發(fā)育繁殖等方面。本研究中不同AM真菌在5種樹木根際分布的結果顯示，林木和菌根真菌之間的共生關系具有一定的相互選擇性，同種宿主林木根際有多種AM真菌分布，同種AM真菌也能分布在不同林木根際。本研究發(fā)現(xiàn)尾葉桉根際中分布的AM真菌均為無梗囊霉屬，有研究將孔窩無梗囊霉(A.foveata)、光壁無梗囊霉(A.laevis)、美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)接種于尾葉桉根系，能形成叢枝菌根[33-34]，說明無梗囊霉屬為尾葉桉根際的優(yōu)勢屬，尾葉桉對AM真菌具有較強的選擇性。杧果根際中有球囊霉屬、根內根孢囊霉和刺無梗囊霉，AM真菌多樣性較豐富。構樹根際有球囊霉屬和摩西斗管囊霉的分布，接種摩西斗管囊霉能促進構樹幼苗在石灰土基質上生長，并能增加總生物量的積累[15,35]。

本研究是國內首次對紅花羊蹄甲和黃梁木根際中AM真菌的侵染狀況做了相關調查，鑒定出其根際分布的AM真菌種類。其中，硬囊霉屬僅在紅花羊蹄甲根系中發(fā)現(xiàn)，兩者間應具有互相選擇性，且專一性相對較強。對于黃梁木根際土樣中AM真菌孢子的鑒定，多個孢子檢測大致都偏向一種AM真菌的分布，摩西斗管囊霉在多個黃梁木根際土孢子鑒定樣本中均為最匹配序列，可推測黃梁木對于AM真菌的分布狀況具有一定的選擇性。

經過對華南主要樹木根際AM真菌的侵染狀況調查，及對AM真菌多樣性及其分布的研究，為進一步研究AM真菌與宿主林木相互選擇關系，林木AM真菌功能多樣性，以及AM真菌促進林木吸收土壤磷素等養(yǎng)分生理生化機制奠定基礎。