張 涵 ，解長(zhǎng)占 ，李太元 ，哈 卓 ，李卓昕 ，李成輝 ，李金鳳 ，4，趙冠宇，4，郭影成，魯會(huì)軍，金寧一

豬細(xì)小病毒（PPV）是一種小型的、非包膜的、單鏈DNA病毒。豬細(xì)小病毒病是由PPV引起的一種豬繁殖障礙病，主要表現(xiàn)為胚胎和胎兒的感染和死亡，會(huì)產(chǎn)出畸形胎、死胎或木乃伊胎，特別是初產(chǎn)母豬，但母豬本身無(wú)明顯癥狀[1]。細(xì)小病毒包括細(xì)小病毒亞科和濃病毒亞科兩個(gè)子科。細(xì)小病毒亞科病毒感染脊椎動(dòng)物，又被進(jìn)一步劃分為細(xì)小病毒屬、紅病毒屬和依賴病毒屬；濃病毒亞科病毒感染節(jié)肢動(dòng)物，下設(shè)濃病毒屬、艾特拉病毒屬和康特拉病毒屬3個(gè)病毒屬。PPV隸屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬。

目前除經(jīng)典PPV（稱為PPV1）外，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的細(xì)小病毒[2-3]。雖然到目前為止，已經(jīng)確定了7個(gè)PPV基因型（PPV1—PPV7），但對(duì)新發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒的理化特性、傳播途徑及致病性研究甚少。豬細(xì)小病毒7型（Porcine parvovirus 7，PPV7）是2016年P(guān)alinski等[4]利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，在美國(guó)豬群肛門拭子中發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)小病毒。然而，在全球豬群中，PPV7的臨床體征和分布仍有待確定。PPV7基因全長(zhǎng)為4 103 bp，包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）：左側(cè)ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1），右側(cè)ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白（Cap）。目前只有我國(guó)和美國(guó)有過(guò)PPV7相關(guān)報(bào)道[5-6]。

本研究從東北地區(qū)采集150個(gè)樣品，從中檢測(cè)得到的3個(gè)病毒株，并對(duì)其進(jìn)行NS1和CP基因序列測(cè)序，并與GenBank中登錄經(jīng)典毒株的NS1和CP基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析，以確定這3個(gè)病毒株的PPV亞型，同時(shí)測(cè)定與其他病毒的共感染情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在東北地區(qū)某些豬場(chǎng)，采集肺臟樣品150份：黑龍江省肇州縣15份，遼寧省沈陽(yáng)市15份，遼寧省大連市15份，黑龍江省巴彥縣15份，吉林省乾安縣30份，黑龍江省天佑公司30份；吉林省吉林市豐滿區(qū)30份。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒等：購(gòu)自天根生化科技有限公 司；DL2000核 酸Marker： 購(gòu) 自TaKaRa公司；TransStart Fastpfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart Fastpfu Fly Buffer、Trans1-T1：購(gòu)自全式金公司；pClone 007 Blunt Vector、10×Topo Mix： 購(gòu) 自TSINKE公 司；AxyPrep質(zhì) 粒DNA小量試劑盒：購(gòu)自AXYGEN；瓊脂糖：購(gòu)自invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考NCBI登錄號(hào)KU563733全基因序列，應(yīng)用Primer Permier 5.0軟件，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物。引物由庫(kù)美生物有限公司合成（表1）。

表1 根據(jù)NCBI中PPV7KU563733設(shè)計(jì)的引物

1.2.2 病料核酸（DNA）提取 將病料組織液，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，再將產(chǎn)物（DNA）置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽(yáng)性樣品檢測(cè) 用PPV7檢測(cè)引物，對(duì)上述產(chǎn)物（DNA）進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR體系為25 μL：ddH2O 14 μL、dNTP 5 μL、Fly Buffer 2.5 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、Fly 酶 0.5 μL、DNA 樣品1 μL。PCR反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性2 min、95℃變性 20 s、53 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s、72 ℃再延伸10 min；35個(gè)循環(huán)。取10 μL PCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠跑電泳后進(jìn)行觀察。在大小對(duì)應(yīng)位置有條帶的疑似為陽(yáng)性樣品。

1.2.4 目的基因分段擴(kuò)增 將上述疑似的陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：ddH2O 14 μL、dNTP 5 μL、Fly Buffer 2.5 μL、 上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、Fly 酶 0.5 μL、DNA樣品1 μL。PCR反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性20 s、退火30 s（每對(duì)引物有對(duì)應(yīng)的退火溫度）、72 ℃延伸30 s、72 ℃再延伸10 min；35個(gè)循環(huán)。取10 μL PCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠跑電泳后進(jìn)行觀察。

1.2.5 基因的克隆、測(cè)序 從瓊脂糖凝膠中，切回大小正確的條帶進(jìn)行膠回收；將目的條帶連接到pCLone 007 Blunt vector上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞；挑取單個(gè)菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約12 h。用小提試劑盒提取質(zhì)粒，送庫(kù)美生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 序列比對(duì)與分析 根據(jù)各片段之間相互重疊的部分，用DNAMAN 6.0將測(cè)序成功的各片段依次拼接，獲得完整的全基因序列；采用DNASTAR 7.1和MEGA 5.2 等軟件，將其與GenBank中發(fā)表的流行毒株的基因序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析所檢測(cè)毒株的遺傳變異特征。

1.2.7 混合感染檢測(cè) 在150 個(gè)肺臟樣品中，先檢測(cè)PPV7陽(yáng)性個(gè)數(shù)，再檢測(cè)PPV7陽(yáng)性樣品中感染其他病毒包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)環(huán)病毒（TTSUV）、PPV2、PPV3、PPV4、PPV6的個(gè)數(shù)，之后計(jì)算共感染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)與基因片段擴(kuò)增

對(duì)150 份肺臟樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出PPV7陽(yáng)性樣品31份，陽(yáng)性率為20.7%；將陽(yáng)性樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)病毒株的片段與預(yù)期片段大小基本一致（圖1），其他陽(yáng)性樣品因結(jié)構(gòu)特殊，不能完成測(cè)定。

2.2 NS1和CP基因測(cè)序

將測(cè)序結(jié)果拼接后獲得NS1和CP基因序列：3個(gè)毒株的NS1基因序列大小分別為2 019、2 020和2 019 bp，CP基因序列大小均為1 409 bp。3個(gè)病毒株分別命名為PPV7-China/DB2018-5、PPV7-China/DB2018-13和 PPV7-China/DB2018-5-71。

2.3 NS1和CP基因同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析

圖1 3個(gè)毒株的3個(gè)基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析顯示：這3個(gè)毒株與GenBank收錄的PPV7毒株KU563733、KY996756、KY996757、KY996758的 NS1同源 性 分 別 為 94.4%～95.2%、94.1%～95.1% 和93.5%～94.3%，CP同源性分別為89.6%～91.8%、89.8%～92.0%和89.6%～91.7%。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析，確認(rèn)3株P(guān)PV毒株為PPV7亞型（圖2～圖5）2.4 混合感染檢測(cè)

圖2 鑒定毒株與經(jīng)典PPV7毒株NS1同源性比對(duì)結(jié)果

圖3 鑒定毒株與經(jīng)典PPV7毒株NS1進(jìn)化樹(shù)

圖4 鑒定毒株與經(jīng)典PPV7毒株的CP同源性比對(duì)結(jié)果

圖5 鑒定毒株與經(jīng)典PPV7毒株CP進(jìn)化樹(shù)

混合感染檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)檢出的31份PPV7陽(yáng)性樣品進(jìn)行其他7種病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PPV7 與其他病毒的混合感染情況較為普遍，與上述7種病毒均有混合感染，其中與PCV2和PPV2的共感染率較高，分別為58.0%和61.3%（圖6）。結(jié)果提示，需要加強(qiáng)對(duì)東北地區(qū)多種病毒混合感染的控制，尤其是PPV7與PCV2、PPV2混合感染的控制。

3 結(jié)論

本研究對(duì)從東北地區(qū)檢測(cè)出的3個(gè)PPV病毒株的NS1和CP基因序列，與PPV7經(jīng)典毒株序列進(jìn)行同源性比對(duì)和分析，證實(shí)該3個(gè)病毒株為PPV7亞型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PPV7與PCV2、PPV2的混合感染率較高。這為東北地區(qū)防控PPV7提供了參考，并豐富了我國(guó)PPV7分子流行病學(xué)資料。

圖6 肺臟樣品中PPV7與其他病毒的混合感染情況