楊 威，牛歡青，陳曉春，陳 勇，朱晨杰，柳 東，莊 偉，應(yīng)漢杰

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211800)

在好氧發(fā)酵過(guò)程中，從氣相到液相的氧傳遞是影響微生物生長(zhǎng)和代謝物生成的重要因素。O2在培養(yǎng)基中的可溶性非常低，不足的O2供應(yīng)限制了好氧生物合成過(guò)程。氧載體是一種在水相中不混溶的輔助液體，這些液體比水具有更高的O2溶解性，對(duì)微生物無(wú)毒性，同時(shí)還能起到消泡作用[1]。氧載體越來(lái)越多地被用于解決發(fā)酵過(guò)程中溶氧(DO)水平的限制問(wèn)題，與增加攪拌速度、通氣量或者分壓等方法相比，其具有無(wú)需額外能源消耗的優(yōu)勢(shì)。目前，常用的氧載體有碳氟化合物、碳?xì)浠衔锖透鞣N油(如，合成硅油或植物油)。許多烷烴，包括正十二烷和正十六烷，作為氧載體能夠有效地提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，例如：添加正十二烷能夠提高小白鏈霉菌StreptomycesalbulusPD-1發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的能力[2]，正十六烷作為氧載體能夠改善Phaffiarhodozyma細(xì)胞生長(zhǎng)以及類(lèi)胡蘿卜素生產(chǎn)[3]。

環(huán)磷酸腺苷 (cAMP) 具有多種生理、藥理功能，且在許多生物過(guò)程中起到重要調(diào)控功能，因而被廣泛研究。目前，已報(bào)道能用于生產(chǎn)cAMP 的微生物有Microbacterium、Corynebacteriummurisepticum、Brevibacteriumliquefaciens、Streptomycesantibioticus和Arthrobacter[4]。有關(guān)發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP的研究主要集中在菌種篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、代謝調(diào)控和發(fā)酵動(dòng)力學(xué)等方面[5]。

筆者所在課題組在前期工作中篩選到1株能夠利用葡萄糖生產(chǎn)cAMP的節(jié)桿菌Arthrobactersp.CGMCC 3584，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中DO是影響cAMP產(chǎn)量的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)中，筆者擬通過(guò)添加氧載體以提高發(fā)酵過(guò)程中氧傳遞效率，進(jìn)而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成，進(jìn)一步檢測(cè)關(guān)鍵酶酶活以及胞內(nèi)核苷酸水平的變化，以初步探究氧載體促進(jìn)cAMP生成的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

節(jié)桿菌Arthrobactersp.CGMCC 3584，南京工業(yè)大學(xué)應(yīng)漢杰教授課題組篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[5]配制。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵

將保藏的甘油菌接種于平板培養(yǎng)基活化，30 ℃培養(yǎng)48 h。平板培養(yǎng)基上的菌苔接種于種子培養(yǎng)基(500 mL搖瓶裝液量為30 mL)，30 ℃、280 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵液(500 mL搖瓶裝液量為40 mL)，30 ℃、280 r/min搖床培養(yǎng)72 h，檢測(cè)產(chǎn)物產(chǎn)量。

1.2.2 5 L發(fā)酵罐批次發(fā)酵

采用5 L攪拌式發(fā)酵罐(BioFlo 110型,New Brunswick Scientific公司)進(jìn)行批次發(fā)酵，裝液量為3 L，接種量10%(體積分?jǐn)?shù))。發(fā)酵條件參照文獻(xiàn)[5]，發(fā)酵液中的DO水平由DO探頭檢測(cè)。

1.2.3 氧載體的添加

考察不同氧載體的最適添加量時(shí)，在發(fā)酵初始階段分別添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%(體積分?jǐn)?shù))的氧載體(正癸烷、正十二烷、正十四烷和正十六烷)，發(fā)酵72 h后檢測(cè)菌體干質(zhì)量(DCW)以及cAMP產(chǎn)量，結(jié)果中列出的是每種氧載體的最佳添加量下的檢測(cè)值?？疾煺樽钸m添加時(shí)間時(shí)，分別在發(fā)酵進(jìn)行了0、12、24、36和48 h后加入2% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷，而后在發(fā)酵進(jìn)行了72 h后檢測(cè)DCW以及cAMP產(chǎn)量。以不添加氧載體的發(fā)酵過(guò)程為對(duì)照組，每個(gè)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在發(fā)酵初始添加2%(體積分?jǐn)?shù))的正十六烷，而后檢測(cè)相應(yīng)發(fā)酵參數(shù)。以不添加氧載體的發(fā)酵過(guò)程為對(duì)照組，每個(gè)發(fā)酵罐批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 DCW、葡萄糖含量以及cAMP測(cè)定

DCW、葡萄糖含量以及cAMP測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.2.5 氧傳遞系數(shù)KLa的測(cè)定

在5 L 攪拌式發(fā)酵罐中(裝液量為3 L)，向培養(yǎng)基中分別添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%(體積分?jǐn)?shù)) 的正十六烷，進(jìn)行氧傳遞系數(shù)KLa的測(cè)定。KLa采用Na2SO3flow-feeding method測(cè)定，參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。以不添加氧載體的過(guò)程為對(duì)照組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 酶活測(cè)定

在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，收集的細(xì)胞用Tris-HCl(pH 7.0)緩沖液沖洗2遍，緩沖液重懸后用JY92-Ⅱ型超聲破儀(新芝生物科技有限公司)超聲破碎，8 000g4 ℃離心10 min，上清液用于酶活測(cè)定。

磷酸果糖激酶(PFK)，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)和腺苷酸環(huán)化酶的酶活測(cè)定方法分別參照文獻(xiàn)[4]。蛋白質(zhì)檢測(cè)用考馬斯亮藍(lán)法。以不添加氧載體的過(guò)程為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 胞內(nèi)核苷酸水平的測(cè)定

在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，收集細(xì)胞用于胞內(nèi)核苷酸水平的測(cè)定。胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)水平采用GloMaxR-Multi+Detection System (Promega公司)測(cè)定。胞內(nèi)NADH和NAD+水平測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。以不添加氧載體的過(guò)程為對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧載體的篩選結(jié)果

為了有效改善發(fā)酵體系中的溶氧水平，在發(fā)酵初始階段添加了各種不同濃度的氧載體，以不添加氧載體為對(duì)照，發(fā)酵72 h后檢測(cè)DCW和cAMP產(chǎn)量值。4種氧載體(正癸烷、正十二烷、正十四烷和正十六烷)在最適濃度下對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響如表1所示。由表1可知：添加2% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷的效果最佳，DCW和cAMP的產(chǎn)量分別達(dá)到7.52 g/L和6.49 g/L，比對(duì)照分別提高了14.5%和15.2%(6.53 g/L和5.67 g/L)。

表1 添加不同氧載體搖瓶發(fā)酵72 h后的DCW和cAMP產(chǎn)量

進(jìn)一步研究了正十六烷的最佳添加時(shí)間。在搖瓶發(fā)酵中，在不同時(shí)間(0、12、24、36和48 h)接種后加入2% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷，發(fā)酵72 h后檢測(cè)cAMP產(chǎn)量，結(jié)果如表2所示。由表2可知：在發(fā)酵的一開(kāi)始(0 h)添加正十六烷效果最佳，DCW和cAMP的產(chǎn)量分別達(dá)到7.73 g/L和6.58 g/L。在Acetobactersuboxydans發(fā)酵產(chǎn)山梨糖[8]、P-h-a-f-f-i-ar-h-o-d-o-z-y-m-a產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素[3]及Saccharomycescerevisia產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸[9]的研究中，觀察到類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 不同時(shí)間添加2% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷72 h后的DCW和cAMP產(chǎn)量

2.2 5 L發(fā)酵罐中正十六烷對(duì)cAMP生產(chǎn)的影響

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行節(jié)桿菌的批次發(fā)酵，在發(fā)酵初始添加2% (體積分?jǐn)?shù))的正十六烷，發(fā)酵過(guò)程曲線如圖1所示。

圖1 5 L發(fā)酵罐中添加正十六烷對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of n-hexadecane on the fermentation in a 5-L bioreactor and the control

由圖1可知：添加2% 的正十六烷后，糖耗速率、細(xì)胞生長(zhǎng)速率和cAMP的積累均有一定的提高。發(fā)酵72 h后，DCW和cAMP的產(chǎn)量分別達(dá)到10.85 g/L和8.87 g/L，比對(duì)照分別提高了19.4%和23.2%(9.09 g/L和7.20 g/L)。同時(shí)，單位細(xì)胞cAMP產(chǎn)量從0.79 g/g增加到0.82 g/g(以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計(jì))，即合成能力提高了3.8%。在添加氧載體后，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度由14.0 g/L下降到12.0 g/L。發(fā)酵過(guò)程中，DO在指數(shù)生長(zhǎng)期明顯下降，到穩(wěn)定期前期維持在一個(gè)較低水平，在添加氧載體后DO有一定提高，特別是在發(fā)酵18 h左右。

溶氧體積傳遞系數(shù)(KLa)值是發(fā)酵罐發(fā)酵中一個(gè)十分重要的參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，在5 L發(fā)酵培養(yǎng)體系中，考察正十六烷添加量對(duì)KLa的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 添加正十六烷的體積分?jǐn)?shù)對(duì)KLa的影響Fig.2 Effect of n-hexadecane volume fraction on KLa

由圖2可知：當(dāng)正十六烷的添加量由0.5%上升至2%時(shí)，KLa與添加濃度的關(guān)系幾乎呈線性；當(dāng)正十六烷的添加量再增大時(shí)，KLa的增加減緩，到6%時(shí)慢慢趨于平衡。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵體系中添加2%的正十六烷，KLa比對(duì)照提高了19.2%。因?yàn)樵诤醚醢l(fā)酵過(guò)程中，低供氧速率一般會(huì)使菌體的生長(zhǎng)受到O2的限制。在水溶液中O2的溶解度通常低于10 mg/L，而在正十六烷中，溫度為22～30 ℃時(shí)，O2的溶解度能達(dá)到190～340 mg/L。因此，在烴-水分散體系中的O2溶解度明顯高于水中[10]。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入更多的有機(jī)溶劑后，體系的氧吸收能力增加，如含有27% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷時(shí)，氧傳遞速率比預(yù)測(cè)提高了58.5%[11]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)：在培養(yǎng)基中添加不同比例的正十六烷時(shí)，KLa先隨著正十六烷添加濃度的增加而增加，在體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)達(dá)到最高值，而后降低。這是由于低濃度的正十六烷對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且能夠提高O2供應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成，而高濃度的正十六烷會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)造成影響。

2.3 添加正十六烷對(duì)關(guān)鍵酶酶活和胞內(nèi)核苷酸水平的影響

磷酸果糖激酶(PFK)、6-磷酸-葡萄糖脫氫酶(G6PDH)和腺苷酸環(huán)化酶(AC)分別是糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑以及cAMP合成途徑的關(guān)鍵酶[12]。為進(jìn)一步了解氧載體對(duì)胞內(nèi)微環(huán)境的影響，考察分批發(fā)酵中添加正十六烷對(duì)cAMP合成途徑中關(guān)鍵酶的酶活以及胞內(nèi)核苷酸水平的影響，結(jié)果如表3所示。

由表3可知：這3個(gè)關(guān)鍵酶的比酶活均在發(fā)酵24 h后達(dá)到最高值，且添加2% (體積分?jǐn)?shù))的正十六烷對(duì)酶活影響不大。在Aspergillusniger[13]和Saccharomycescerevisiae[9]添加氧載體的培養(yǎng)過(guò)程中均觀察到類(lèi)似的現(xiàn)象。

表3 添加2%正十六烷對(duì)關(guān)鍵酶比酶活的影響

最后，考察正十六烷對(duì)胞內(nèi)核苷酸水平的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知：胞內(nèi)NADH和NAD+水平隨著發(fā)酵進(jìn)程的延長(zhǎng)而減少，且在好氧條件下，NAD(H)水平主要以氧化態(tài)NAD形式存在。

與對(duì)照相比，添加正十六烷條件下,NADH/NAD+的比率更低。NADH/NAD+比率反映了胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，其受到外部電子受體的可用性和性質(zhì)的影響。溶氧水平能夠影響胞內(nèi)NADH/NAD+的比率，在高溶氧水平下，NADH含量以及NADH/NAD+比率相應(yīng)降低[14]。筆者推測(cè)正十六烷的添加改善了發(fā)酵液中的溶氧水平，因而胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而降低了NADH/NAD+比率。

圖3 添加正十六烷對(duì)胞內(nèi)核苷酸水平的影響Fig.3 Comparison of the intracellular nucleotide levels in the cells cultured for different time with 2% n-hexadecane and the control

但是與對(duì)照相比，胞內(nèi)的ATP含量在指數(shù)生長(zhǎng)期快速降低，同時(shí)添加正十六烷使得胞內(nèi)ATP含量降低。這是因?yàn)锳TP為酶反應(yīng)提供能量，并在代謝網(wǎng)絡(luò)中作為底物、產(chǎn)物、激活劑或者抑制劑，參與調(diào)節(jié)眾多生物反應(yīng)過(guò)程[15]。研究表明，在釀酒酵母中，糖酵解通量與胞內(nèi)ATP含量呈負(fù)相關(guān)性[16]，在大腸桿菌中，低的胞內(nèi)ATP/ADP 比率可促進(jìn)糖酵解途徑的通量[17]。在本研究中，ATP不僅是胞內(nèi)維持細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的主要能量物質(zhì)，也是cAMP合成途徑中的重要底物。因此，添加正十六烷后，胞內(nèi)ATP含量的降低可能與更高的糖耗速率以及cAMP生成速率相關(guān)。

液態(tài)烷烴作為氧載體能夠有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[2,9]，本研究首次提出利用添加正十六烷的方法提高節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)cAMP產(chǎn)量的方法，同時(shí)測(cè)定了cAMP合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶活性以及節(jié)桿菌胞內(nèi)核苷酸水平，初步闡述了正十六烷促進(jìn)cAMP合成的生理機(jī)制。

3 結(jié)論

在節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)cAMP的過(guò)程中，4種氧載體的添加對(duì)cAMP的生成都有促進(jìn)作用，其中，發(fā)酵初期添加2% (體積分?jǐn)?shù))正十六烷的效果最佳。在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，添加2%正十六烷后，DCW和cAMP的產(chǎn)量分別達(dá)到10.85 g/L和8.87 g/L，比對(duì)照分別提高了19.4%和23.2%。同時(shí)，正十六烷的添加改變了細(xì)胞的胞內(nèi)核苷酸水平，胞內(nèi)NADH/NAD+比率以及胞內(nèi)ATP水平均有一定程度降低。研究表明，在發(fā)酵體系中添加適當(dāng)?shù)难踺d體能夠改善氧供應(yīng)，促進(jìn)好氧菌的細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)物積累。