， ， ， ， ， (深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司， 廣東 深圳 518040)

蕨類植物也稱羊齒植物，是介于苔蘚植物和種子植物之間的一個獨(dú)具特色的高等植物類群，在西方素有“無花之美”之稱[1-2]。蕨類植物是觀賞植物的重要組成部分，不僅可用于園林造景、室內(nèi)盆栽、立體綠化等方面，也可用于水體凈化、重金屬修復(fù)和邊坡綠化等[3-5]。隨著路橋和隧道等工程大量建設(shè)產(chǎn)生的裸露坡面日益增多，邊坡修復(fù)工程已成為目前生態(tài)環(huán)境建設(shè)的一項(xiàng)重要內(nèi)容[6]。目前邊坡綠化防護(hù)工程常用的技術(shù)有客土噴播、濕法噴播、植生袋和混播植草等，而濕法噴播因具有均勻、省時和省種等特點(diǎn)，應(yīng)用比較廣泛[7-8]。我國大部分工程在噴播中主要選用喬灌草的模式，但隨著灌木的生長，草本植物會逐漸退化，一定程度上影響了邊坡穩(wěn)定性[9]。而蕨類植物一般都具有較強(qiáng)的耐蔭性，大部分也可以產(chǎn)生大量孢子，若能適當(dāng)?shù)陌艳ь愭咦咏Y(jié)合喬灌草利用濕法噴播運(yùn)用到邊坡修復(fù)中，不僅可以解決后期草本植物退化后林下空腳的問題，也可豐富邊坡植物種類和增強(qiáng)邊坡生態(tài)群落穩(wěn)定性。但蕨類植物孢子一般比較小，萌發(fā)受到光照、溫度和水分等多種條件的影響[10]，這在一定程度限制了蕨類孢子能以草本植物種子一樣的方式進(jìn)行噴播。而人工種子技術(shù)是植物繁殖的一個途徑，也可以一定程度上控制作物生長發(fā)育和抗性[11-12]。通過在人工胚乳中添加一些營養(yǎng)液、植物激素、碳源或抗菌劑等，可以顯著提高種子萌發(fā)率，增加植物的繁殖速度，有的甚至可以促進(jìn)植物生長[13-15]。但是目前關(guān)于華南地區(qū)自然分布的蕨類孢子萌發(fā)研究還不夠完善，特別是孢子人工種子技術(shù)方面的研究數(shù)據(jù)幾乎沒有，為促進(jìn)蕨類孢子未來在邊坡綠化中應(yīng)用，本試驗(yàn)以華南毛蕨、蜈蚣蕨、線羽鳳尾蕨和烏毛蕨4種蕨類孢子為研究對象，通過正交試驗(yàn)研究了在人工胚乳中添加MS、激素和多菌靈對孢子萌發(fā)的影響，并進(jìn)一步研究了不同光照和儲存時間對孢子人工種子萌發(fā)的影響。

1 材料和方法

1.1 材 料

參試材料為線羽鳳尾蕨、華南毛蕨、蜈蚣蕨和烏毛蕨的成熟孢子，其孢子葉采集后于室內(nèi)蔭晾 2～3 d 并收集，儲存于 4 ℃冰箱。

1.2 方 法

將各處理放置在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25～30 ℃，光照強(qiáng)度 2 000～2 500 lx，相對濕度 75%～85%，光照時間 12 h/d。

1.2.1 篩選孢子人工種子促萌最佳組合

稱取 0.002 g 孢子倒入10 mL 含 1.5%海藻酸鈉的包埋劑中，制成孢子懸浮液，然后將孢子懸浮液倒入直徑 9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中，使孢子液均勻分布于培養(yǎng)皿中，最后將盛有孢子液的培養(yǎng)皿浸泡在 2%的氯化鈣溶液中，15 min 后取出培養(yǎng)皿，用蒸餾水漂洗 2～3 次，即得蕨類孢子海藻酸鈣平板。

采用 L9(34)正交試驗(yàn)法研究人工種子包埋劑中添加不同濃度的 MS 大量元素、KT、赤霉素及多菌靈對蕨類孢子萌發(fā)的影響。正交試驗(yàn)中因素和水平如表 1 所示，各處理編號見表 2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)的因子和水平設(shè)計(jì)

水平因子大量元素KT濃度(mg/L)GA3濃度(mg/L)多菌靈濃度(%)10000.0521/2MS0.2250.103MS0.5500.20

表2 包埋劑正交試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

處理編號 大量元素 KT濃度(mg/L) GA3 濃度(mg/L) 多菌靈濃度(%) 1 MS 0.2 50 0.052 MS 0.5 0 0.103 1/2MS 0 50 0.104 1/2MS 0.5 25 0.055 1/2MS 0.2 0 0.206 0 0.5 50 0.207 0 0 0 0.058 MS 0 25 0.209 0 0.2 25 0.10

1.2.2 不同光質(zhì)對孢子人工種子萌發(fā)的影響

對4種蕨類孢子人工種子平板進(jìn)行制作，制作方法如1.2介紹，包裹劑設(shè)置為 MS+GA350 mg/L+多菌靈 0.05%，然后放置于 4 種光照下進(jìn)行培養(yǎng)。不同光質(zhì)的配比及光照度如表 3 所示。

表3 不同光質(zhì)的配比和光照強(qiáng)度

編號 LED光質(zhì) 光照強(qiáng)度(lx)G1全光譜 2220～2720 G2紅光 510～660 G3紅光 830～1260 G4紅藍(lán)4∶11040～1200 G5紅藍(lán)6∶11060～1210

1.2.3 不同貯藏時間對孢子萌發(fā)的影響

通過添加促萌物質(zhì)(ck,未加 GA3和MS的海藻酸鈣平板)和不添加促萌物質(zhì)(添加GA3和MS的海藻酸鈣平板)，定時對儲藏孢子的萌發(fā)率進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用最小顯著差數(shù)(LSD)法在α=0.05水平對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選孢子人工種子促萌最佳組合

正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，培養(yǎng)12 d時4種蕨的孢子萌發(fā)率在各處理間差異極顯著，其中處理5，6，9中萌發(fā)率均為0，華南毛蕨和烏毛蕨在處理2中萌發(fā)率也為0。其他處理中，線羽鳳尾蕨的萌發(fā)率為66.12%～81.65%，華南毛蕨為 32.55%～66.45%，烏毛蕨為 33.7%～76.38%，蜈蚣蕨的萌發(fā)率為42.23%～92.31%。

方差分析結(jié)果(表5)表明，大量元素濃度，KT 濃度和多菌靈濃度對4 種蕨類孢子萌發(fā)率具有極顯著的影響，而GA3濃度對華南毛蕨、烏毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌發(fā)率具有極顯著的影響，但是對線羽鳳尾蕨孢子萌發(fā)并無明顯的促進(jìn)作用。綜合來看，4個因素對不同蕨類孢子萌發(fā)的影響主次關(guān)系分別為：線羽鳳尾蕨 D>A>B>C，華南毛蕨B>D>A>C，烏毛蕨 D>B>A>C，蜈蚣蕨 D>B>A>C，因此 KT 濃度和多菌靈濃度對其影響較大，大量元素和 GA3濃度影響較小。

各因素對蕨類孢子萌發(fā)影響結(jié)果見表6，從大量元素濃度看，添加大量元素均有利于提高孢子萌發(fā)率，除了烏毛蕨孢子在 50%大量元素濃度培養(yǎng)條件下萌發(fā)率較高以外，其余 3 種蕨類孢子萌發(fā)率隨著大量元素濃度增加而增加，因此促萌的最佳大量元素濃度為 100%；KT 濃度的影響則相反，未添加 KT 處理的孢子萌發(fā)率均高于添加處理，說明孢子萌發(fā)不需要添加KT；GA3作為一種可破眠催芽的生長激素，添加 25～50 mg/L 時可以促進(jìn)孢子萌發(fā)；抑菌劑多菌靈濃度越高，萌發(fā)率越低，因此以添加 0.05%的低濃度為宜。綜上所述，蕨類孢子萌發(fā)的最優(yōu)組合為 A3B1C3D1,即在人工種子中添加 MS 大量元素，赤霉素 50 mg/L，多菌靈0.05%，可有效促進(jìn)孢子萌發(fā)。

表4 不同包裹劑對4種蕨類孢子人工種子萌發(fā)的影響(12 d)

物種 處理編號萌發(fā)率(%)線羽鳳尾蕨180.13±4.25a線羽鳳尾蕨266.12±5.43b線羽鳳尾蕨367.19±4.01b線羽鳳尾蕨481.65±3.31a線羽鳳尾蕨50.00±0.00c線羽鳳尾蕨60.00±0.00c線羽鳳尾蕨767.68±9.13b線羽鳳尾蕨871.34±6.48b線羽鳳尾蕨90.00±0.00c華南毛蕨162.36±4.08a華南毛蕨20.00±0.00d華南毛蕨353.13±2.76b華南毛蕨432.55±1.20c華南毛蕨50.00±0.00d華南毛蕨60.00±0.00d華南毛蕨763.25±4.44a華南毛蕨866.45±1.36a華南毛蕨90.00±0.00d烏毛蕨162.46±5.53b烏毛蕨20.00±0.00d烏毛蕨362.17±2.55b烏毛蕨475.41±1.80a烏毛蕨50.00±0.00d烏毛蕨60.00±0.00d烏毛蕨776.38±7.03a烏毛蕨833.7±6.12c烏毛蕨90.00±0.00d蜈蚣蕨192.31±6.85a蜈蚣蕨242.23±3.41b蜈蚣蕨387.53±4.78a蜈蚣蕨491.00±1.77a蜈蚣蕨50.00±0.00c蜈蚣蕨60.00±0.00c蜈蚣蕨788.05±1.40a蜈蚣蕨887.04±3.63a蜈蚣蕨90.00±0.00c

注：不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著。

表5 不同包裹劑對 4 種蕨類孢子人工種子萌發(fā)率影響的方差分析

變異來源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 FSig. 線羽鳳尾蕨大量元素(A) 11271.407 2 5635.704 127.015 0.000 KT 濃度(B) 7907.630 2 3953.815 89.109 0.000 GA3濃度(C) 192.074 2 96.037 2.164 0.144 多菌靈濃度(D) 12682.296 2 6341.148 142.914 0.000 華南毛蕨大量元素(A) 2229.556 2 1114.778 231.531 0.000 KT 濃度(B) 12680.222 2 6340.111 1316.792 0.000 GA3濃度(C) 1418.667 2 709.333 147.323 0.000 多菌靈濃度(D) 6561.556 2 3280.778 681.392 0.000 烏毛蕨大量元素(A) 1961.556 2 980.778 72.551 0.000 KT 濃度(B)7226.000 2 3613.000 267.263 0.000 GA3濃度(C) 1216.222 2 608.111 44.984 0.000 多菌靈濃度(D) 18781.556 2 9390.778 694.660 0.000 蜈蚣蕨大量元素(A) 9272.889 2 4636.444 410.439 0.000 KT 濃度(B) 15854.222 2 7927.111 701.744 0.000 GA3濃度(C) 1569.556 2 784.778 69.472 0.000 多菌靈濃度(D) 18528.667 2 9264.333 820.121 0.000

注：R方=0.976(調(diào)整R方=0.965)。

表6 各因素對 4種蕨類孢子人工種子萌發(fā)率的影響

因素水平 萌發(fā)率均值(%)線羽鳳尾蕨華南毛蕨烏毛蕨蜈蚣蕨大量元素A022.56 21.1125.4429.3350%49.4428.5645.8959.56100%72.56 43.0032.0073.78KT 濃度 B0 68.6761.0057.4487.560.2mg/L 26.7820.7820.7830.670.5mg/L 49.1110.8925.1144.44GA3濃度 C0 44.5621.1125.4443.4425mg/L50.8933.1136.3359.3350mg/L49.1138.4441.5659.89多菌靈濃度 D0.05% 76.4452.7871.3390.330.1% 44.3317.6720.7843.330.2% 23.7822.2211.2229.00

2.2 不同光質(zhì)對孢子人工種子萌發(fā)的影響

表7表明，在5種不同光照下，線羽鳳尾蕨萌發(fā)率在 58.71%～71.28%之間，其中全光照(G 1)下萌發(fā)率最高，顯著高于G 2、G 4和G 5，但與G 3相差不明顯，說明G 1和G 3在一定程度上可以促進(jìn)線羽鳳尾蕨孢子萌發(fā)；華南毛蕨的萌發(fā)率為 39.33%～53.19%，其中紅光(G 2)下萌發(fā)率最高，顯著高于G 1、G 3和G 5，但與G 4相差不明顯，說明G 2和G 4在一定程度上可以促進(jìn)華南毛蕨孢子萌發(fā)；烏毛蕨萌發(fā)率為31.79%～55.08%，紅光(G 3)下萌發(fā)率最高，顯著高于其它4種光，說明G 3可以促進(jìn)烏毛蕨孢子萌發(fā)；而蜈蚣蕨的萌發(fā)率均高于80%，且各處理間基本上無明顯差異，說明這幾種光對蜈蚣蕨孢子萌發(fā)沒有影響。

表7 不同光質(zhì)對 4 種蕨類孢子人工種子萌發(fā)的影響(12 d)

物種光萌發(fā)率(%)發(fā)育階段線羽鳳尾蕨G171.28±7.42a絲狀體G264.32±2.79c絲狀體G370.55±4.95ab絲狀體G458.71±0.72c絲狀體G564.75±5.58bc絲狀體華南毛蕨G139.33±3.98c片狀體G253.19±3.23a絲狀體G342.65±2.73bc片狀體G448.76±5.77ab片狀體G540.48±2.07bc片狀體烏毛蕨G131.79±5.94de片狀體G246.16±7.51bc片狀體G355.08±6.55a片狀體G40.00±0.00g-G50.00±0.00g-蜈蚣蕨G185.04±3.50ab片狀體G286.31±1.31ab幼配子體G383.33±5.67bc片狀體G488.77±4.34a幼配子體G587.07±3.99ab幼配子體

注：不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 不同貯藏時間對孢子萌發(fā)的影響

儲藏時間對蕨類孢子萌發(fā)的影響如表 8所示，儲藏 30 d 時除了線羽鳳尾蕨的對照處理萌發(fā)率僅為26.55%以外，其余3種蕨的萌發(fā)率均在 90%以上；儲藏超過 6 個月時蜈蚣蕨和烏毛蕨的萌發(fā)率為0，華南毛蕨的萌發(fā)率從 93%下降至67%，在儲藏時間為 9 個月時華南毛蕨萌發(fā)率僅為28.30%，而線羽鳳尾蕨的萌發(fā)率也降低至39%?？梢娺@4種蕨類孢子儲藏時間不宜超過半年。

表8 不同儲藏時間對孢子人工種子萌發(fā)的影響

物種處理萌發(fā)率(%)30d60d150d180d270d線羽鳳尾蕨ck26.55±8.8767.68±9.1371.7±5.5256.76±8.3716.56±1.96促萌86.15±2.3581.65±3.3166.7±5.9671.09±7.9739.71±1.36華南毛蕨ck92.39±1.9163.25±4.4456.51±4.3267.09±6.650.00±0.00促萌93.65±1.7766.45±1.3664.6±4.5342.96±4.2928.30±6.51蜈蚣蕨ck90.61±2.8288.05±1.4089.53±3.180.00±0.000.00±0.00促萌95.88±2.2192.31±6.8585.17±6.110.00±0.000.00±0.00烏毛蕨ck93.25±2.7876.38±7.0373.67±2.650.00±0.000.00±0.00促萌93.87±0.9475.41±1.834.66±3.090.00±0.000.00±0.00

采用孢子作為蕨類植物繁殖材料宜隨采隨播，若需儲藏，儲藏時間不宜超過 6 個月；通過海藻酸鈣法對蕨類植物孢子進(jìn)行包埋可在一定程度上促進(jìn)孢子的萌發(fā)，適宜的包埋劑為海藻酸鈉 1.5%+MS+GA350 mg/L+多菌靈 0.05%+2%氯化鈣。

3 結(jié)論與討論

3.1 篩選孢子人工種子促萌最佳組合

人工種子在自然條件下的萌發(fā)率決定著其能否在生產(chǎn)上應(yīng)用，但關(guān)于人工種子有菌萌發(fā)的研究并不理想，通常在人工種子制作過程中添加殺菌劑、防腐劑和植物激素等，一定程度上可以促進(jìn)人工種子的萌發(fā)率[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，大量元素濃度，KT 濃度和多菌靈濃度對 4 種蕨類孢子萌發(fā)率具有極顯著的影響，而 GA3濃度只對華南毛蕨、烏毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌發(fā)率具有極顯著的影響。KT 濃度和多菌靈濃度對4種蕨類孢子人工種子萌發(fā)的影響較大，大量元素和 GA3濃度影響較小。大量元素有利于提高孢子人工種子萌發(fā)率，KT不利于萌發(fā)，添加 25～50 mg/L GA3可以促進(jìn)萌發(fā)，抑菌劑多菌靈的濃度越高，萌發(fā)率越低，以添加 0.05%的低濃度為宜。人工種子中添加 MS 大量元素，赤霉素50 mg/L，多菌靈0.05%，可有效促進(jìn)孢子萌發(fā)。

研究表明，選擇胚狀體制作人工種子時，在人工胚乳中加入一定量的蔗糖、碳源或其他營養(yǎng)物質(zhì)有利于促進(jìn)人工種子的萌發(fā)[19-20]。特別是培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度對大部分蕨類植物孢子萌發(fā)有顯著影響，但不同蕨類孢子的最適培養(yǎng)基不同，如薄葉碎米[21]在1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，腎蕨[22]孢子的萌發(fā)在不同培養(yǎng)基上差異不顯著，而銀粉背蕨[23]、蕨菜[24],粗梗水蕨[25]在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，這與本文的研究結(jié)論相同，即在人工種子中添加MS培養(yǎng)基可以有效促進(jìn)4種蕨類孢子的萌發(fā)。一般情況下，赤霉素可以打破孢子休眠進(jìn)而促進(jìn)孢子萌發(fā)[26]，Antonietta[27]研究發(fā)現(xiàn)，在茶枝柑人工種子中附加GA3能夠?qū)⒚劝l(fā)率由26.7%提高到50%。王曉倩研究發(fā)現(xiàn)，用100 mg/L的赤霉素處理闊鱗鱗毛蕨孢子可以有效的促進(jìn)其萌發(fā)[28]，蔣勝軍等研究也發(fā)現(xiàn)，用5.77 mol/L的赤霉素處理猴腿蹄蓋蕨孢子可以促進(jìn)其萌發(fā)[29]。但本研究發(fā)現(xiàn)，GA3對華南毛蕨、烏毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌發(fā)率具有極顯著的影響，而對線羽鳳尾蕨影響不顯著，可能是因?yàn)榫€羽鳳尾蕨孢子不具有休眠特性。

本研究發(fā)現(xiàn)，未添加 KT 的處理孢子萌發(fā)率均高于添加處理，說明KT不利于這4種孢子萌發(fā)。而黃超群研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加KT對紅蓋鱗毛蕨和井欄邊草孢子萌發(fā)影響不大[30]，這可能是由于不同孢子休眠特性和自身含有內(nèi)源激素共同作用進(jìn)而導(dǎo)致對外界激素生理反應(yīng)的結(jié)果不同。

3.2 不同光質(zhì)對孢子人工種子萌發(fā)的影響

自然狀態(tài)下，大多數(shù)蕨類孢子需要在光照條件下才能萌發(fā)[31]，但不同蕨類孢子的萌發(fā)對不同光質(zhì)的反映不同。如王禾等通過研究紅光和白光對粗莖鱗毛蕨孢子萌發(fā)影響發(fā)現(xiàn)，紅光能促進(jìn)孢子提早萌發(fā)1 d左右，但對提高萌發(fā)率效果不顯著[32]，張光飛等研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣蕨的孢子需要在光照條件下才能萌發(fā)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)處理12 d時，G 1(全光照)和G 3(紅光長)在一定程度上可以提高線羽鳳尾蕨孢子的萌發(fā)率；G 2(紅光短)和G 4(紅藍(lán)光4∶1)可以提高華南毛蕨孢子的萌發(fā)率；G 3(紅光)可以提供烏毛蕨孢子萌發(fā)率；而蜈蚣蕨孢子的萌發(fā)率在這4種光下沒有顯著性差異。導(dǎo)致這些差異的原因可能是孢子的萌發(fā)除了與外界環(huán)境條件相關(guān)外還與自身的遺傳特性等相關(guān)。

3.3 不同貯藏時間對孢子萌發(fā)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，線羽鳳尾蕨在儲藏60 d時萌發(fā)率最高，隨儲藏時間延長萌發(fā)率降低，可見線羽鳳尾蕨適合采收后2個月播種，這和沈曉嵐[34]的研究結(jié)果相似，即二叉鹿角蕨的孢子經(jīng)過消毒儲藏2～3個月后萌發(fā)率最高，隨后萌發(fā)率隨時間延長逐漸降低。而其它3種蕨在儲藏30 d時萌發(fā)率最高，隨后萌發(fā)率逐漸降低，可見這3種蕨適合隨采隨播?？赡苁且?yàn)椴煌N蕨類植物孢子的活力和壽命有差異，其次蕨類孢子是否含有葉綠體也影響其儲藏時間，一般含有葉綠體的孢子，不經(jīng)過休眠可直接萌發(fā)，而不含有葉綠體的孢子要經(jīng)過一段時間才能萌發(fā)，但孢子的活力會保持更久，也可以貯藏較長時間[10]。

綜上所述，一定的激素處理和適宜的儲存時間及光照可以促進(jìn)線羽鳳尾蕨、華南毛蕨、蜈蚣蕨和烏毛蕨的孢子萌發(fā)，這4種蕨又是邊坡常見種類，自然傳播能力強(qiáng)，可以考慮在邊坡植被建植中進(jìn)行推廣。但孢子萌發(fā)是一個復(fù)雜的基因調(diào)控過程，它不僅與自身的遺傳特性有關(guān)，也與外界環(huán)境條件息息相關(guān)，特別是原葉體向孢子體轉(zhuǎn)化的過程，這個時期對外界環(huán)境極其敏感，在孢子數(shù)量一定的情況下，采取一定的技術(shù)措施才能保證后期的成苗量，但目前的研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此如何根據(jù)邊坡立地條件、施工工藝、植物配置等不同而有的放矢的采取促萌、保濕及包衣等措施來保證孢子萌發(fā)及生長所需的光照、水分和養(yǎng)分等條件，還有待進(jìn)一步研究。